禽结核菌素生产用菌种的制备与鉴定

为制备禽结核菌素国家标准品,研究禽结核菌素生产用菌株禽分枝杆菌的菌种特性,对1992年冻干保存的3株菌CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203进行复苏,采用SPF鸡复壮,分离培养后冻干了新批次菌种,对菌种形态、生化特性、培养特性、毒力和抗原性进行了鉴定。结果表明,制备的菌种纯粹,形态、生化和培养特性符合禽分枝杆菌的生物学特征,免疫原性符合的兽用生物制品质量标准的规定。本研究为禽分枝杆菌的鉴定提供参考,也为制造禽结核菌素的工艺改进奠定基础。

带有氯霉素抗性基因标记的重组布氏杆菌S2的构建及其生物学特性

无法区分免疫接种和自然感染是限制布氏杆菌疫苗应用的主要原因。本研究通过基因同源重组技术,用氯霉素抗性基因(Cmr)替代布氏杆菌弱毒S2株的WbkC基因,筛选获得重组布氏杆菌rS2-WbkC株。试验发现,重组菌rS2-WbkC由原先的光滑型转变成粗糙型。rS2-WbkC在TSA培养基上传25代后仍能稳定表达氯霉素抗性蛋白。小鼠动物试验模型表明,rS2-WbkC与S2有相似的保护性,但rS2比S2具有更高的安全性。rS2-WbkC免疫小鼠后,其抗血清可通过平板凝集试验与S2免疫的血清相区分。本研究为布氏杆菌标记疫苗的研制提供了技术平台。

补体结合酶联免疫吸附试验方法的建立

为改进免疫学诊断技术的准确性,研究了一种基于补体结合的免疫学检测新技术———补体结合酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)。CF-ELISA技术采用酶标记抗菊糖纯化豚鼠补体C3抗体及其酶显色系统作为补体参与反应的指示系统,用ELISA方法进行补体结合试验。经对布氏菌病抗体检测的初步试验结果显示,CF-ELISA技术可检测到0.01 IU的布氏菌病抗体,灵敏度与间接酶联免疫吸附试验(iELISA)相当,是虎红平板凝集试验(RBPT)试管凝集试验(SAT)的5 000倍、补体结合试验(CFT)的10 000倍。对349份确诊布氏菌病感染群牛、羊血清的检测结果显示,CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性率分别为35.82%3、6.39%、31.81%、30.09%、36.1%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阳性符合率分别为:98.4%、88.8%、80.0%、90.6%。CF-ELISAi、ELISA、CFT、SAT、RBPT对490份布氏菌病阴性群牛、羊血清的阴性率分别为100%、99.6%、100%、99.4%、99.8%,CF-ELISA与iELISA、CFT、SAT、RBPT的阴性符合率分别为:99.6%1、00%、99.4%、99.8%。研究表明,CF-ELISA是具有高特异性和高敏感性的布氏菌病免疫学检测技术。

动物布鲁氏菌病防治研究进展

布鲁氏菌病至今依然是在世界范围内流行的人畜共患传染病。除牛种、羊种、猪种、绵羊副睾种、犬种布鲁氏菌病的流行外,最近又发现了海洋种布鲁氏菌病的存在。对布鲁氏菌病的病原学诊断已从传统的分离培养鉴定发展到应用PCR、基因探针等分子生物学技术,诊断的敏感性大大提高了。在血清学诊断方面,ELISA技术已经成为国际公认的成熟技术。在预防用疫苗方面,牛用RB51和羊用M111两种粗糙型疫苗开辟了布鲁氏菌病防治的新领域,将更有效地推动布鲁氏菌病的防治效果。

动物布氏菌病的诊断

布氏菌病（又称布鲁氏菌病，以下简称布病）是一种细菌性人畜共患传染病。世界大多数国家都有流行。由于带菌动物是其它动物和人类布病的主要传染源，因此，对动物的布病的诊断、防治就成为本病防治的关键。迄今，有多种技术成熟、可用国际标准来标定、比较的血清学方法可供诊断用。病原诊断也已经有成熟的分子生物学诊断技术。

用纯化布鲁氏菌抗原消除耶尔辛氏菌O:9交叉反应的研究

在布鲁氏菌病的血清学诊断中,由于耶尔辛氏菌0:9血清型感染所引起的假阳性反应是布鲁氏菌病血清学诊断中存在的最严重的问题之一。国内外为解决这一问题进行了多方面的研究,但至今还没有一种试验方法能被广泛接受并得到大面积的应用。考虑到耶尔辛氏菌O:9血清型感染引起的与布鲁氏菌的血清学交叉反应是因为耶尔辛氏菌0:

TP干粉培养基对布鲁氏菌生物学特性的影响试验

布鲁氏菌对胎盘及胎儿组织比对其它组织更为嗜好,其原因是胎盘及胎儿组织中含有大量的赤鲜醇,而赤鲜醇是布鲁氏菌最好的营养物质。有试验证明0.2微克赤鲜醇就能刺激布鲁氏菌在机体细胞内生长繁殖。在体外也有同样的作用。牛、绵羊。

用小鼠检测布鲁氏菌病疫苗免疫效力的研究

本文探讨了采用小鼠测定布鲁氏菌病疫苗免疫效力的可行性。经对 A19、S2和 M—111布鲁氏菌弱毒菌和45/20灭活佐剂苗的免疫攻毒试验,表明用小鼠是一种简便、可靠、精确的方法。此方法适用于布鲁氏菌病疫苗免疫效力的检验,亦适用于布鲁氏菌菌株的免疫原性测定。

布氏杆菌病疫苗的应用和研究现状

布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的一种重要的人兽共患病。布氏杆菌具有宿主广泛、传染性强以及感染后根治困难等特点,对畜牧业和人类健康均构成严重威胁,疫苗免疫是预防和控制布氏杆菌病的主要措施。迄今国内外已有多个弱毒活疫苗在使用,但均存在一定的缺陷,因此研究更理想的疫苗一直是控制布氏杆菌病的重点。目前除了常规诱变筛选新的弱毒株外,人们正通过基因工程技术构建重组弱毒疫苗、DNA疫苗以及亚单位疫苗。本文简述了布氏杆菌病疫苗的应用及新型疫苗的研究现状。

布鲁氏菌S2 WboA基因缺失株的构建及免疫效果

【目的】WboA基因编码光滑型布鲁氏菌脂多糖(LPS)O-侧链合成必须的糖基转移酶,该基因的缺失或破坏会影响布鲁氏菌光滑型表型的形成。本研究拟构建WboA基因缺失的重组粗糙型布鲁氏菌,以使布鲁氏菌弱毒疫苗与野毒株布鲁氏菌感染相区分。【方法】以猪源光滑型布鲁氏菌S2株为研究对象,通过同源重组将氯霉素抗性基因(Cmr)完全替代S2株的WboA基因,获得重组粗糙型布鲁氏菌rS2-WboA株。【结果】rS2-WboA株在适宜的培养基(TSA)上传50代后仍保持对氯霉素的抗性。用1×107 CFU rS2-WboA免疫Balb/c小鼠和豚鼠,1个月后均能通过平板凝集试验检测到粗糙型抗体。1×1011 CFU rS2-WboA菌攻毒Balb/c小鼠后,不会引起死亡,并且能抵抗200 CFU强毒M28的攻击。小鼠试验显示了rS2-WboA与原始株S2相似的保护性和更高的安全性,其保护性也略高于另一重组株rS2-WbkC。【结论】WboA可作为构建重组粗糙型布鲁氏菌疫苗株缺失的靶基因。

布鲁菌种属鉴定多重PCR方法的建立及初步应用

用BCSP31作为布鲁菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁菌种间特异性标志,建立了布鲁菌种属特异性的多重PCR鉴定方法。用建立的多重PCR方法对11株(牛种A19,A544,A387;羊种M111,M28,M16;犬种RM6/66;绵羊种63/290;猪种S2,rS2,S1330)不同种来源的布鲁菌菌体和基因组进行鉴定,结果牛种菌能扩增大小分别为494,223,178bp3条带,羊种菌能扩增出大小分别为733,223,178bp3条带,犬种菌能扩增出大小分别为223,178bp2条带,绵羊种菌能扩增出大小分别为976,223,178bp3条带,猪种菌能扩增出大小分别为285,223,178bp3条带,均与预期一致;而作为对照的大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌和都柏林沙门菌,均未扩增出任何条带。结果表明,本研究所建立的方法具有良好的特异性,能够区分不同种源的布鲁菌,可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查。

一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株(B.abortus 343)进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B.abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾(1﹕25 000)或含碱性复红(1﹕25 000)的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B.abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B.abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清(牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M和布鲁氏菌粗糙型血清R)与B.abortus 343抗原的反应性;利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B.abortus 343进行了PCR种属特性鉴定;将B.abortus 343免疫小鼠,分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性;通过小鼠和豚鼠感染试验,全面评价该分离株的毒力;分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,测定B.abortus 343在小鼠体内存活时间;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量;分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠,初步测定分离株对豚鼠的最小感染量(MID),在此基础上,进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B.abortus 343为光滑型牛种布鲁氏菌,菌落逆光观察微带蓝绿色乳光;革兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色,H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长,不依赖于CO2。B.abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应,免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,可在小鼠体内存活29周;以1×109 CFU感染350—400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105—1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1个月后,所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体,试管凝集效价为320—1 280;B.abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌(B.abortus 343),为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株,丰富了布鲁氏菌菌种资源。

肥大细胞对布鲁菌S_2株的模式识别及活化效应的体外研究

目的探讨体外培养的肥大细胞对猪布鲁菌S2株的模式识别及活化效应。方法骨髓来源的肥大细胞在体外感染猪布鲁菌S2株,瑞氏-姬姆萨染色法观察肥大细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色法观察肥大细胞脱颗粒情况;间接ELISA检测S2株感染后1 h和12 h肥大细胞释放组胺、IFN-γ、IL-12的含量;激光共聚焦显微镜检查肥大细胞对S2株的摄取状态;RT-PCR法观察S2株感染后12 h和24 h肥大细胞TLR4和TLR8基因的mRNA的表达;流式细胞术观察S2株感染后24 h肥大细胞TLR4和TLR8蛋白的表达。结果感染猪布鲁菌S2株的肥大细胞形态出现了明显的变化,S2株感染后1 h即出现明显的脱颗粒现象;S2株感染后1 h、12 h肥大细胞上清中组胺含量明显高于正常对照组(P<0.05),未检测到IFN-γ、IL-12;共聚焦显微镜检查发现感染30 min和1 h S2株主要黏附在肥大细胞表面,而未被肥大细胞摄入到细胞内;S2株感染12 h后肥大细胞TLR4mRNA的表达明显高于正常对照组,24 h时表达又减弱,和正常对照组相比,S2株感染24 h时肥大细胞TLR4蛋白的表达增加;S2株感染12 h和24 h后肥大细胞TLR8 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 S2株能黏附在肥大细胞的表面并能激活肥大细胞,引起其脱颗粒,释放组胺,但在实验观察的时间点内未见IFN-γ和IL-12的分泌,其机制可能是S2株通过TLR4被肥大细胞识别,但不能被肥大细胞摄取。

2013年全国省级兽医实验室检测能力比对结果分析

2012年5月,国务院办公厅印发了《国家中长期动物疫病防治规划（2012～2020年）》[1],指出要“提升动物疫情监测预警能力,建立以国家级实验室、区域实验室、省市县三级动物疫病预防控制中心为主体,分工明确、布局合理的动物疫情监测和流行病学调查实验室网络.要加强疫病检测诊断能力建设和诊断试剂管理,充实各级兽医实验室专业技术力量.”可见兽医实验室在国家动物疫病防控体系中的重要战略地位.

负载布氏菌WboA^(-/-)S_2株的树突状细胞对淋巴结T细胞的活化作用

目的:研究猪种布氏菌WboA-/-S2株对骨髓源性树突状细胞(BMDC)的生物学特性及启动T细胞应答能力的影响。方法:用粗糙型布氏菌WboA-/-S2株负载BALB/c小鼠的BMDC,并以光滑型S2株作为对照,采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化并计算吞噬率;用固体培养基涂布法测定负载后不同时间点细胞的载菌量;用ELISA检测负载后不同时间点BMDC分泌IL-12和TNF-α的量以及与淋巴结T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-4的含量。结果:BMDC对WboA-/-S2株的吞噬率高于对S2株的吞噬率(P<0.05),负载1小时BMDC的载菌量明显高于负载S2株的载菌量(P<0.05),但在24小时,WboA-/-S2株负载BMDC的载菌量明显低于S2株负载组(P<0.05)。WboA-/-S2株负载BMDC不同时间点上清中IL-12和TNF-α含量明显高于S2株负载组(P<0.05)。且负载WboA-/-S2株的BMDC刺激T细胞所产生的IFN-γ量均明显高于S2株(P<0.05)。结论:WboA-/-S2株较S2株更易被BMDC吞噬和杀死,其活化BMDC、诱导T细胞应答的能力也明显强于S2株。

布鲁氏菌环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。

布鲁菌S_2株诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡及免疫激活的研究

目的:研究猪布鲁菌S2株诱导巨噬细胞(Mφ)的凋亡、活化及对T淋巴细胞的激活作用。方法:用猪布鲁菌S2株体外感染Mφ,并以大肠埃希菌作为对照,采用瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪测定感染后24小时Mφ的凋亡率;ELISA法检测感染后不同时间点Mφ培养上清中IL-12和TNF-α及感染后Mφ与T细胞共培养上清中IFN-γ的含量的变化。结果:瑞氏-姬姆萨染色显示布鲁菌S2株感染Mφ后1小时体积明显增大,突起增多,胞浆内可见大量布鲁菌;6小时细胞内细菌减少,但胞膜仍完整;至12小时细胞核固缩,胞膜失去完整性。流式细胞仪检测结果显示,感染后24小时Mφ的凋亡率均明显高于正常对照组及大肠埃希菌感染组(P<0.05)。ELISA结果显示S2株感染Mφ12、24、48小时的上清中IL-12和TNF-α含量均明显高于正常对照组(P<0.01),S2株感染后Mφ与T细胞共培养24、48、72小时产生的IFN-γ量高于正常对照组(P<0.05),但低于大肠埃希菌感染组(P<0.01)。结论:S2株可以引起Mφ的凋亡,同时可诱导Mφ活化,产生IL-12和TNF-α;布鲁菌感染后的Mφ可诱导T细胞活化,产生IFN-γ免疫应答。

迁移性树突状细胞与淋巴结内树突状细胞在抗B.suis免疫应答中的作用

目的:研究迁移性树突状细胞与淋巴结内树突状细胞在抗猪布鲁氏菌免疫应答中的作用。方法:48只BALB/c小鼠随机分为3组:Ⅰ组为正常对照组,阴道滴注PBS;Ⅱ组为巨噬细胞(Mφ)清除组,每只小鼠阴道滴入清除剂;Ⅲ组为未清除Mφ组,每只小鼠阴道滴注同体积的liposome-PBS;48小时后Ⅱ组、Ⅲ组均阴道接种猪布鲁氏菌,对照组阴道滴注PBS。各组小鼠分别在接种12、24、48和72小时采集血液和髂内淋巴结,采用免疫组织化学染色法观察淋巴结内树突状细胞(DC)的分布,用ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的含量。结果:未清除Mφ组小鼠接种布鲁氏菌后髂内淋巴结内有大量DC迁移,至12小时血清IFN-γ水平显著增高,与对照组相比差异显著(P<0.05),48小时达到高峰,显著高于对照组(P<0.01)。清除Mφ组小鼠接种布鲁氏菌后,髂内淋巴结内没有明显的DC迁移,各时间点血清IFN-γ水平明显高于PBS对照组(P<0.05),但明显低于未清除Mφ组(P<0.05)。各组IL-4水平的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:迁移性DC和淋巴结内DC在启动抗布鲁氏菌细胞免疫应答中均发挥重要作用,并具有协同作用的特点。