太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。

太平洋鳕线粒体全基因组测序及结构特征分析

通过二代基因测序技术获得太平洋鳕(Gadus macrocephalus)线粒体基因组全序列,对线粒体基因进行了注释,对其序列结构进行了分析。研究结果表明,太平洋鳕线粒体基因组全长16569 bp,共编码13个蛋白质,并且包含了22个tRNA, 2个rRNA以及1个D-Loop区。碱基组成存在明显的AT偏向和弱AT负偏斜现象。太平洋鳕线粒体在蛋白质编码基因中共有5种终止密码子,包含哺乳动物线粒体常见终止密码子AGG与AGA。除tRNA-Ser(GCT)基因缺失二氢尿嘧啶臂(DHU臂)外,其余tRNA均能形成典型的三叶草结构。D-Loop区只存在与终止结合序列区(Terminal associated sequences, TAS)和保守序列框(Conserved sequences blocks, CSB)功能类似的序列,并且出现17 bp的嘧啶序列。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列(OL)及一段74 bp的基因间隔区。基于线粒体基因组全序列和Cytb基因,分别构建了鳕形目下几种鳕的进化树,结果为揭示太平洋鳕进化地位提供了重要依据。

聚肌胞对雏鸡新城疫抗体水平的影响

为研究聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,PolyI:C)对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响,在肉仔鸡7日龄免疫的前后注射PolyI:C,并测定各处理组中雏鸡血清抗体水平。结果显示,免疫之前48、24和12h注射PolyI:C,雏鸡血液中抗体效价仅在10日龄明显升高;免疫新城疫疫苗的同时及免疫之后12、24h注射PolyI:C,9～12日龄雏鸡血清抗体滴度均明显提高。PolyI:C可以提高雏鸡免疫抗体滴度,对由弱毒苗刺激的免疫反应具有调理作用。

红鳍东方鲀GPI基因对急性低盐胁迫的响应机制

为了获得红鳍东方鲀Takifugu rubripes葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-Phosphate Isomerase,GPI)的基因信息及其表达特性,研究采用RT-PCR和实时荧光定量PCR (qPCR)技术进行了GPI基因的克隆、组织表达分析及其在急性低盐胁迫下的基因响应研究。结果显示,所获得的红鳍东方鲀GPI基因序列长1736 bp,包含一个完整的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。ORF由1662个核苷酸组成,编码553个氨基酸;预测的氨基酸序列中有2个糖异构域(Sugar Isomerase Domains),不存在信号肽和跨膜结构域。多序列比对结果表明物种间GPI具有较高的保守性。qPCR结果表明: GPI基因mRNA在红鳍东方鲀鳃、肌肉、脑、肠、肝及肾等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高。在不同盐度胁迫下,在鳃中,各低盐组GPI mRNA相对表达量均呈现先升高后降低又回升的趋势;在肾中,各低盐组GPI mRNA相对表达量变化趋势各有不同。由此推测,GPI基因在红鳍东方鲀对急性低盐胁迫的响应中发挥一定作用。

温度和金属离子对干扰素诱导剂-聚肌胞配对的影响

为提高聚肌胞(Polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)的配对效果,本文研究了温度和金属离子对聚肌胞配对的影响。实验结果显示,在45℃条件下合成的聚肌胞减色效应最强,说明在该温度下聚肌苷酸(Polyinosinic acid,PI)和聚胞苷酸(Polycytidylic acid,PC)配对最紧密;Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+能够增强聚肌胞双链结构的紧密性,当Na+浓度增加到0.085mol/L后,聚肌胞的配对接近饱和;Ca2+、Mg2+、Mn2+和Zn2+对聚肌胞结构的保护效果基本一致,而Cu2+对聚肌胞结构具有明显破坏作用。建议采用45℃合成聚肌胞并添加适当浓度的Na+和Ca2+等增强其结构的紧密性,以避免机体内高活性RNA酶的降解而失去药效。

重组激活基因(RAGs)功能机制及其在鱼类早期发育中的作用

在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育过程中,BCR和TCR基因座(Igκ、Igλ、Igh、Tcrα、Tcrβ、Tcrγ、Tcrδ)的可变区(V)、多样区(D)、链接区(J)发生V(D)J重排,该重排过程是在重组激活蛋白(RAG-1和RAG-2)的作用下完成的,V(D)J重排机制使机体拥有庞大的抗体库,以应对自然界中多元的病原微生物。RAGs结构分为核心区和非核心区,核心区域发挥着重要的基因片段酶切功能,而非核心区域的九聚体序列(nonamer)、锌指等结构具有调节V(D)J重排的功能。RAGs的功能在转录水平、染色体水平以及蛋白水平受到严格的时间和空间调控,以保证B/T细胞的正常发育。随着国内外学者对哺乳动物RAGs基因的结构与功能机制的深入研究,RAGs也在淡水鱼和海水鱼中有了越来越多的报道。由于RAGs的功能特点以及在进化过程中的稳定性,其已成为研究鱼类免疫系统发育过程和系统进化的重要分子标记。本文在赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)RAGs研究的基础上探讨了RAGs定位鱼类免疫系统的发生过程,旨在为鱼类人工繁殖技术的突破、鱼类疫苗的开发与研制以及鱼类免疫学研究等提供理论借鉴。

太平洋鳕仔鱼饥饿实验及不可逆生长点的确定

通过研究饥饿胁迫对太平洋鳕仔鱼生长、形态和行为的影响,确定太平洋鳕仔鱼最佳投饵时间及不可逆点,以期为太平洋鳕人工育苗提供科学参考。实验设饥饿组和摄食组进行研究。结果表明,在水温10.0—11.0℃时,太平洋鳕仔鱼在孵化后第5天开始摄食,此时卵黄囊容量约从初孵时的0.2402mm3降至0.0062mm3,卵黄囊体积随仔鱼生长逐渐变小。从第8日龄开始,饥饿仔鱼的全长、体长、肛前长、体高等指标与摄食组差异极显著(P<0.01),多项生长指标出现负增长,饥饿组与摄食组仔鱼开鳔率及鳔体积差异明显,表明饥饿对仔鱼生长发育起延迟作用。太平洋鳕仔鱼初次摄食率为30%,第7天初次摄食率达90%,仅保持1d。太平洋鳕仔鱼的耐饥饿能力较差,PNR为9日龄。最佳投饵时间为5—7日龄。

植酸酶对红鳍东方鲀幼鱼生长、消化酶及消化率的影响

以初始体质量为(4.58±0.05)g的红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼为对象,进行为期60 d的饲养试验,研究植酸酶对红鳍东方鲀幼鱼生长、消化酶、消化率的影响。试验设6组:对照组D1,全鱼粉蛋白组;对照组D2,以豆粕替代30%鱼粉蛋白组;试验组S1～S4,在豆粕替代30%鱼粉蛋白基础上设4个不同的植酸酶添加水平(500、1 000、1 500、2 000 U/kg),每个组设3个重复。结果表明:各组幼鱼成活率没有显著差异(P>0.05);D1组幼鱼各项生长指标均最优,D2组幼鱼生长性能指标较D1组显著降低(P<0.05);添加植酸酶后,试验组幼鱼的生长状况得到一定程度的改善,添加植酸酶≥1 000 U/kg时,幼鱼的终末体质量、特定生长率较D2组明显提高(P<0.05),饵料系数较D2组显著降低(P<0.05);添加植酸酶能提高幼鱼肠道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力;植酸酶一定程度上能提高干物质的消化率,但不明显(P>0.05);添加1 000 U/kg植酸酶时,幼鱼的蛋白表观消化率达到最高;添加1 000、1 500 U/kg植酸酶时,能显著提高幼鱼的脂肪消化率(P<0.05);添加植酸酶后,幼鱼的磷消化率较D2组显著升高(P<0.05)。研究结果表明,在本试验条件下,饲料中添加植酸酶可以促进红鳍东方鲀幼鱼生长、改善消化,建议饲料中植酸酶的适宜添加量为1 000～1 500 U/kg。

饲料脂肪水平对红鳍东方鲀幼鱼肝脏抗氧化酶活力及组织结构的影响

以脂肪质量分数分别为5.77%、7.71%、8.93%、11.89%、13.75%、16.42%的饲料饲喂红鳍东方鲀(Takifugurubripe)幼鱼56 d,测定其肝脏抗氧化酶活力和总抗氧化能力,并对其肝脏、肠及肌肉进行组织学观察,研究不同饲料脂肪水平对红鳍东方鲀幼鱼肝脏抗氧化酶活力及组织结构的影响。结果表明,5.77%组过氧化氢酶(CAT)活力与其他各组间有显著性差异(P<0.05)。总抗氧化能力(T-AOC)活力的最高值出现在8.93%组,且显著高于其他各组(P<0.05)。饲料脂肪水平大于8.93%的实验组间超氧化物歧化酶(SOD)活力差异不显著(P>0.05),且显著低于8.93%组;5.77%、7.71%、8.93%组呈增加趋势,且各组间差异显著(P<0.05)。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的峰值出现在13.75%组,且显著高于其他各组(P<0.05),总体呈先增加后降低的趋势。组织学观察表明,5.77%、7.71%、8.93%组,虽然肝脏也有脂肪空泡存在,但是肝脏、肠和肌肉组织结构完整,无明显病变现象;11.89%、13.75%、16.42%组的肝脏、肠和肌肉均有不同程度的病变现象,各组间差别明显。由此认为,脂肪水平为8.93%组,抗氧化酶活力最高,该脂肪水平下的饲料对红鳍东方鲀幼鱼肝脏代谢最有利,组织结构完整无病变。

太平洋鳕ATG5基因的克隆及表达分析

ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一种自噬相关基因,是形成自噬体的重要基因,ATG5基因的表达对自噬调控的成熟有重要作用。本研究中通过克隆,首次得到太平洋鳕Gadus macrocephalus ATG5c DNA部分序列,该序列长为895 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码275个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量约为32 200;经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5核苷酸序列与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高达87.27%;利用太平洋鳕与其他物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,ATG5核苷酸序列系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点;氨基酸序列分析结果显示,ATG5蛋白氨基酸序列具有较高的保守性;利用绝对荧光定量PCR方法对ATG5基因在太平洋鳕各组织中的转录水平进行检测,结果显示,肝、脾和肾中的表达量高于其他组织,鳃、肾、脾、脑、肝和肌肉各组织中的ATG5 mRNA拷贝数分别为11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究结果将为进一步研究太平洋鳕细胞吞噬机制奠定基础,也为太平洋鳕的免疫机理和相关研究提供基础数据。

太平洋鳕IRF3基因的克隆及绝对定量表达分析

本研究通过克隆首次得到太平洋鳕(Gadus macrocephalus)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的部分序列。该序列长1878 bp,包含长1377 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51 k D。经氨基酸序列比对发现,太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明,太平洋鳕IRF3与其他物种的IRF3亲缘关系较近。应用绝对荧光定量PCR方法对IRF3在不同组织和不同日龄(days post-hatching,dph)仔鱼的表达水平进行检测,并对干扰素在仔鱼期的免疫作用进行分析。组织表达绝对定量结果显示,性腺,肝和胸腺表达量高于其他组织。不同日龄仔鱼IRF3表达量结果显示,IRF3在受精卵就已经表达,在25 dph表达量大幅提高。本研究的结果为进一步研究太平洋鳕干扰素作用机制以及其在早期发育中的作用奠定了基础。

太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体p MD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和Ig M基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕RAG1和Ig M基因绝对荧光定量PCR方法。为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和Ig M的表达情况。结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;Ig M的回归方程为y=-3.119x+27.61,回归系数R2=0.998。绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;Ig M基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾。RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;Ig M基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高。研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测。

PolyI∶C不同途径诱导大菱鲆Mx蛋白基因的转录

以PolyI∶C(又称聚肌胞)为诱导剂,分别通过腹腔注射、浸泡和投喂3种途径诱导大菱鲆Scophthalmus maximus体内抗病毒蛋白Mx基因的转录,利用半定量RT-PCR方法检测干扰素下游基因-Mx基因的转录水平来确定该诱导剂的诱导效果。结果显示,以上3种途径都能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,均在48h之后达到高峰,其中以浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,且在120h时仍保持较高水平。Mx基因转录的时相变化证明了国产PolyI∶C可以通过多种途径诱导抗病毒蛋白Mx的表达,为实际应用中确定用药途径提供了理论依据。另外,实验初步建立了半定量RT-PCR方法,为检测鱼体内干扰素的表达提供了技术方法。

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。

太平洋鳕抗菌肽Hepcidin基因克隆及体外表达研究

为揭示太平洋鳕Gadus macrocephalus抗菌肽Hepcidin(GmHep)的分子结构和表达特性,利用qPCR法对平均体质量为2.438 kg鳕不同组织和发育早期的GmHep表达模式进行了探讨,分别构建了原核(pET-32a-GmHep)和真核(pEGFP-GmHep)表达载体,研究了GmHep的体外表达特点。结果表明:GmHep基因开放阅读框长为297 bp,编码98个氨基酸,蛋白相对分子质量为10833.56,该肽N端具22个氨基酸残基的信号肽,成熟肽含有8个半胱氨酸残基、4个二硫键;氨基酸序列比对发现,GmHep与大西洋鳕Hepcidin同源性最高(93%),但与其他鱼类Hepcidin同源性较低(小于60%),预示其功能具有独特性;GmHep在肝脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),且GmHep在5、10、30、37、40日龄仔稚鱼中均有表达(P<0.05);GmHep体外诱导表达优化条件为IPTG浓度0.01 mmol/L、30℃、诱导4 h;GmHep在EPC细胞系中主要定位在细胞质中。研究表明,本研究成功构建了两种GmHep体外表达载体,确定GmHep为肝分泌型,且在太平洋鳕发育早期发挥一定作用。

大头鳕TNFSF6基因的结构分析及其在发育早期和病毒暴发时的表达水平

为揭示大头鳕TNFSF6基因的基本结构与功能及其在大头鳕发育和神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus, PCNNV)暴发时的响应机制,本研究通过基因克隆获得TNFSF6 cDNA开放阅读框序列,并对序列进行生物信息学分析,运用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对TNFSF6在不同组织、孵化后不同日龄仔鱼和PCNNV感染前后仔稚鱼中的表达水平进行检测。结果显示,大头鳕TNFSF6 cDNA长1 388 bp,5′UTR占315bp,3′UTR占500 bp,ORF全长573 bp,编码190个氨基酸。qRT-PCR结果显示,TNFSF6在各组织均有表达,但在脾脏和鳃组织中的表达量较高;大头鳕孵化后15、20、37和40 d TNFSF6基因的转录水平分别是其在5 d转录水平的0.28、0.15、0.12和0.13倍。在24 d和46 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6基因的转录水平高于对照组;在77 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6转录水平则显著低于对照组。研究表明,TNFSF6基因在大头鳕发育早期和仔鱼暴发PCNNV时发挥了重要的作用。

安氏伪镖水蚤精氨酸激酶cDNA的克隆及镍胁迫下的表达特性

为探讨镍胁迫对桡足类影响的分子机制,以安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)为研究对象,采用cD-NA末端快速扩增技术(RACE)方法获得了安氏伪镖水蚤精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)cDNA全序列,全长1 180bp,开放阅读框1 068bp,编码355个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为39.43ku.Blast分析结果显示,安氏伪镖水蚤AKcDNA与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、多齿新米虾(Neocaridina denticulata)和光滑双脐螺(Bi-omphalaria glabrata)AK基因具有较高的同源性(77%～82%).荧光定量PCR结果显示:低质量浓度镍(10μg/L)对AK转录水平呈现峰值效应,高质量浓度(40和500μg/L)镍则对AK呈现抑制效应,表明AK与安氏伪镖水蚤响应重金属胁迫密切相关.本研究为揭示镍胁迫对桡足类的影响机制提供理论依据.

基于转录组技术的枫叶鲑亲本鉴定和杂交优势分析

为探究枫叶鲑的亲本来源及杂种抗病优势,采用Illumina高通量测序技术对枫叶鲑的胸腺和头肾组织转录组进行测序分析。结果获得胸腺组织原始数据8224345800 bp,拼接获得169204条单基因序列(Unigene);头肾组织原始数据7409864400 bp,拼接获得132292条Unigene。利用生物信息学方法对Unigene进行NR库相似搜索,还进行了GO、KOG和KEGG分类注释。通过比对线粒体DNA(mtDNA)基因序列发现,枫叶鲑与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的线粒体基因同源性达99%以上,可判定枫叶鲑母本是虹鳟;E3、TNF-α、IGM等基因的同源性在大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)中比虹鳟高,推测枫叶鲑父本可能是大鳞大麻哈鱼。对免疫相关基因分析发现,IgM、TNF-α和T、B淋巴细胞相关基因序列与父、母本同源性均较高,因此初步判定枫叶鲑抗病优势是父、母本双方杂交的结果。通过转录组分析杂交种的抗病优势存在盲区,但该技术可以快速判断父、母本的来源,获得大量遗传信息,优势明显。

海水鱼神经坏死病毒致病机理研究进展

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)主要分布在地中海和太平洋西海岸,已在120多种鱼中被检测到,能引起鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN),是对海水鱼类危害重大的病原之一。目前,随着神经坏死病毒的基因序列、类型、诊断和预防技术等方面研究的不断深入,其致病机理的报道也越来越多。本文概述了病毒附着、致病基因、细胞凋亡以及免疫逃避等几个方面的研究现状。