水稻乙酰乳酸合酶Ala179Val突变赋予ALS抑制剂类除草剂广谱抗性

为了鉴定新型水稻突变体ALS179对乙酰乳酸合酶(ALS,acetolactate synthase)抑制剂类除草剂的抗性,本研究以野生型水稻华航31(HH31)、耐咪唑啉酮除草剂水稻ALS627突变体和甲基磺酸乙酯(EMS,ethyl methyl sulfone)诱变的新型水稻突变体ALS179为试验材料,通过不同浓度下的4类乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂包衣浸种和苗期喷施处理,进一步测定表型及相关酶活性指标来探究突变体ALS179的抗性。结果表明,经过除草剂包衣浸种以及苗期喷施处理后,突变体ALS179对苯磺隆、咪唑乙烟酸、双草醚及啶磺草胺具有不同程度的抗性,且乙酰乳酸合酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性随除草剂浓度的升高呈下降趋势。除了20×,30×的咪唑乙烟酸处理条件下过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性低于野生型HH31外,其他处理条件下ALS179的乙酰乳酸合酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶活性均高于野生型HH31。因此,本研究发现Ala179Val突变赋予了对ALS抑制剂类除草剂的广谱抗性,为后续ALS类除草剂广谱抗性水稻品系的培育提供遗传种质资源。

两个水稻生殖器官突变体的形态特征和遗传分析

我们在转基因水稻后代中发现了两个生殖器官发育相关的隐性突变体,暂命名为function of reproductive organ1（fro1）和pistilloid-stamen（ps-2）。fro1突变体内外稃闭合,抽穗但不开花;4轮器官结构及数目近正常,但内外稃片抱合扭曲成辣椒状,雌雄蕊发育不完全,无花粉形成,雌蕊不育。ps-2突变体类似Luo等（2006）报道的ps突变体：颖花开裂,内外颖片变窄、变硬,外颖弯曲,但ps只有1-5枚雄蕊转化成雌蕊,而ps-2有5-6枚雄蕊转化成雌蕊,仅有极少数突变颖花留有1枚未转变的雄蕊,突变体雌蕊状结构10个以上,不能结实。通过对突变体fro1和ps-2分别与野生型明恢86正反杂交,与R527、93-11和中花16的杂交后代表型分离规律分析表明：突变体fro1和ps-2是分别由一对隐性基因控制的突变体,其中fro1的F2后代表型分离比均符合3：1,大部分ps-2的F2后代表型分离比偏离3：1。进一步分析fro1和ps-2双突变体的遗传和表型发现：fro1和ps-2基因不等位,是两个独立遗传的基因。植株生活力受纯合ps-2基因的影响,但不受纯合fro1基因的影响。双突变体的内外稃片结构及开裂特征似ps-2,而内外稃包合状与fro1近似,雄蕊仍表现雌化,但数目明显减少。fro1和ps-2双突变体的表型特征暗示了ps-2和fro1间存在一定的互作。

水稻穗顶部退化突变体L-05261的遗传分析

稻穗顶部小穗退化降低单株产量,严重影响水稻单产。对穗顶部明显退化材料L-05261的研究表明,小穗退化可能与稻穗内部过氧化氢的积累有关。2个非穗顶部退化品种和2个轻微穗顶部退化品种与L-05261杂交所得F1植株稻穗顶部都呈现穗退化表型,F2群体的小穗退化率均呈连续分布,但表型偏向非穗退化亲本。在组合L-05261×IRAT129F2群体中,顶部小穗退化与非退化单株的比例适合63︰1;同一组合的BC1F1回交群体中,顶部小穗退化与非退化植株比例接近7:1。表明穗顶部小穗退化表型受3对或3对以上显性或部分显性基因控制。利用上述群体中的182个单株,在第3、第4、第5、第8染色体上分别检测到qPAA3、qPAA4、qPAA5和qPAA84个QTL,它们之间不存在互作,合计可解释46.32%的表型变异,其余的表型变异可能是由环境条件的变化造成的。

基于基因组编辑技术的水稻靶向突变特征及遗传分析

TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)系统和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是当前广泛应用的两大基因组编辑技术。本文比较分析了水稻(Oryza sativa L.)中这两大系统诱导突变的突变率、突变类型、突变位置、突变时间和遗传模式,发现TALEN系统和CRISPR/Cas9系统均可在T_0代水稻中有效诱发位点特异性突变,且CRISPR/Cas9的突变率更高。两大系统都以诱发10 bp以内的In Del突变为主,TALEN系统易诱导10 bp以内的缺失突变,而CRISPR/Cas9系统易诱导1 bp的插入突变,且CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)位置更加精确。此外,DSBs在修复过程中能以低频同源重组(Homologous recombination,HR)途径修复,产生DNA片段重复突变。对于相邻双靶点CRISPR/Cas9系统而言,双靶点间的DNA片段可发生缺失或倒位,这种双靶点间DNA片段突变的发生频率与双靶点各自的突变率无正相关性。两大系统诱导的突变最早发生在已转化的愈伤组织中,少量发生在水稻的体细胞中,导致了纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变4种遗传模式,其中双等位突变比例最高,嵌合突变比例最低。除嵌合突变外,纯合突变、杂合突变、双等位突变的突变序列均可稳定遗传给下一代。

一个水稻开颖不育突变体ohs1(t)的遗传分析及基因定位

我们在明恢86的转基因后代中发现了一个水稻花器官发育突变体,暂命名为开颖不育(open hull sterile1,ohs1(t))突变体。ohs1(t)突变体表现颖花开裂,内外稃片变细,内稃微弯向外稃,有雌雄蕊分化,但雌雄蕊较野生型株的小,大多数花药没有花粉,少数花药中含有不育花粉,雌雄配子均不育。突变体ohs1(t)分别与明恢86、R527、93-11和中花16号杂交后代遗传分析表明,ohs1(t)是一个隐性基因控制的突变体。以ohs1(t)和93-11杂交F2群体中突变个体作为初步定位群体,采用已报道的SSR标记将OHS1(t)初步定位在1号染色体的长臂端RM493和RM5638两个标记间。随后利用已公布的水稻基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/index.html)及93-11和日本晴间SSR标记数据库(http://www.gramene.org/),新开发和筛选了SSR和In-Del标记,并以ohs1(t)和中花16号杂交F2群体中突变个体作为新定位群体,将OHS1(t)基因进一步定位在NSSR0115和InDel0102之间,遗传距离分别为0.2cM和0.3cM,物理距离约66kb。

水稻耐低温逆境研究:分子生理机制及育种展望

低温严重影响水稻的地理分布、生长发育及产量。水稻在低温逆境下会产生一系列的生理及代谢变化,如:叶绿素荧光的改变,电解质渗漏增加,活性氧、丙二醛、蔗糖、脂质过氧化物、脯氨酸等代谢物含量升高,植物内源激素ABA和GA的改变等。了解水稻在低温逆境下的生理代谢变化及低温应答分子机理对水稻耐低温性状的遗传改良具有重要的意义。本文系统总结了水稻在低温逆境下的生理代谢变化、已定位和克隆的耐低温基因/QTL,以及水稻应答低温逆境信号转导机制的最新研究进展,以期为水稻的耐低温育种提供参考。

水稻顶部小穗退化性状的QTL分析

利用水稻籼粳亚种间组合越光与桂朝2号构建的重组自交系群体,在3种环境下对水稻穗顶部小穗退化性状进行了数量性状基因座(QTL)分析。重组自交系群体中穗顶部小穗退化性状的表型均呈连续分布,表现为数量性状遗传,并出现了超亲分离。在RIL群体中共检测到6个QTL,分别位于水稻第1、2、3、5、6和7染色体上,贡献率为4.49%～9.74%。其中,在两地都分别检测到的qASA2位于第2染色体上RM3355―RM263区间;位于第1染色体标记区间RM6451―OSR13的qASA1,LOD值达3.27,其增效等位基因来自桂朝2号。

水稻穗顶部退化基因PAA2的精细定位

鉴定和克隆水稻穗顶部退化突变体新基因,对研究小穗顶部退化的分子机制及克服育种和生产实践中因穗顶部退化引起的产量损失具有重要的理论和现实意义。本研究报道了一个来源于中花11的穗顶部退化突变体,暂命名为Panicle Apical Abortion 2(paa2)。该突变体的穗顶部小穗发育异常、退化,后期退化部分脱落,稻穗形成秃尖,使穗粒数减少。遗传分析表明该突变体受1个显性基因控制。利用群体分离分析法(BSA,bulked segregation analysis)将PAA2基因定位在2号染色体的长臂端L2-33和L2-50之间,物理距离为80 kb的范围内。该研究结果为PAA2基因的图位克隆奠定了基础。

淹水胁迫下褪黑素浸种对水稻幼苗生长的影响

为研究淹水胁迫下褪黑素浸种对长短中胚轴水稻幼苗期生理和生化性状的影响,采用不同浓度梯度的褪黑素(MT)处理,测定中胚轴长、胚芽鞘长、芽长、鲜质量、成活率等相关农艺性状,测定过氧化物歧化酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)含量等生理生化指标。MT浸种对淹水胁迫下水稻生长的影响可分为低浓度缓解胁迫和高浓度加剧毒害;淹水处理下相比短中胚轴品种华航31、DH4040,长中胚轴品种鄂中4号、DH4038具有较高的成活率;在对4个品种添加10,100μmol/L的MT浸种处理时,华航31中MT浸种效果表现均是最好的,其中100μmol/LMT浸种处理在每个品种中均能显著提高幼苗的成活率。随着浓度提高到1000μmol/L,对所有的品种均表现为抑制成活;MT浸种可降低MDA含量,提高POD、SOD、CAT活性,促进中胚轴长、胚芽鞘长、芽长、鲜质量等农艺性状,100μmol/LMT浸种处理效果最好;1000μmol/LMT浸种也可以促进相关农艺性状提升并提高酶活性,但成活率显著下降。适当浓度的褪黑素浸种,能提高淹水胁迫下水稻幼苗活力和出苗率,显著降低淹水胁迫对水稻幼苗的毒害作用。

水稻窄叶突变体nl(t)的遗传分析与基因定位

研究将小粒野生稻基因组DNA通过"穗茎注射法"导入恢复系RH78后产生变异,得到突变体材料nl(t)。遗传分析表明,突变体窄叶性状是由一对隐性核基因控制的,利用分子标记将nl(t)基因定位在水稻第4号染色体长臂上RM5511和RM3843标记之间,物理距离约570 kb的范围内。为进一步研究nl(t)的功能提供参考。

水稻直链淀粉合成调控新基因Wx410的功能与效应分析

【目的】挖掘Wx新等位变异,明确Wx410新等位基因对稻米品质性状的影响。【方法】以Wx^(lv)、Wx^(a)和Wx^(b)等位基因为模板,利用PCR进行第10外显子第101位碱基的A-G单点突变,分别构建了不同Wx等位背景下的Wx410定点突变植物表达载体pEGFC-Wx^(lv)410、pEGFC-Wx^(a)410和pEGFC-Wx^(b)410,阳性对照组载体分别为pEGFC-Wx^(lv)、pEGFC-Wx^(a)和pEGFC-Wx^(b)。通过转化糯稻品种苏御糯,分析该位点的变异对稻米品质的遗传效应。【结果】花后7 d和14 d,转基因植株pEGFC-Wx^(lv)410,pEGFC-Wx^(a)410及pEGFC-Wx^(b)410的胚乳Wx基因表达量较各自的阳性对照材料无显著变化,而颗粒结合淀粉合酶活性极显著降低;转基因植株直链淀粉含量较野生型显著降低,而糊化温度无明显变化;pEGFC-Wx^(a)410及pEGFC-Wx^(b)410的胶稠度较各自的阳性对照材料显著升高,而pEGFC-Wx^(lv)410的胶稠度较其阳性对照材料显著降低。【结论】pEGFC-Wx410为水稻淀粉合成的一个新的功能等位基因,控制的直链淀粉含量为4%~6%,刚好弥补了目前所鉴定的复等位基因所调控的直链淀粉含量在这个范围内的空缺,为稻米食味和加工相关品质改良提供更丰富的遗传资源。

杂交水稻新组合镉低积累臻两优8612大面积推广获得成功

镉低积累臻两优8612(原名莲两优1号)是湖南省农业科学院湖南杂交水稻研究中心与袁隆平农业高科技股份有限公司合作,利用“重离子束诱变和M1TDS定向育种技术”育成的镉低积累杂交水稻新组合(《杂交水稻》2022年第1期),2021—2022年在镉污染农田进行多点试验示范,表现出高产和镉低积累特性(《杂交水稻》2023年第2期)。2023年,该组合在湖南省11个地级市52个县(市、区)推广7.13万hm^(2),全面实现安全生产、丰产增收,成为我国第1个大面积成功应用的镉低积累水稻品种。

OsNRAMP5基因突变低镉型臻两优8612的试验示范及关键栽培技术

在利用重离子诱变结合M_1TDS技术,培育出低镉型臻两优8612(国家镉低积累品种区试中的名称为“莲两优1号”,以下简称“莲两优1号”)基础上,2021—2022年进行多点试验。结果表明:莲两优1号具有稳定的镉低积累特性,在轻中度镉污染大田种植,稻米镉(Cd)不超标;锰(Mn)的吸收下降对其生长和产量没有明显影响;当土壤有效磷(P)极端缺乏时,莲两优1号在黄熟期开始出现叶尖落色变化,但其产量与对照差异不大。基于研究结果提出,推广OsNRAMP5基因突变型镉低积累水稻品种,首先要进行测土分析,选择轻中度镉污染大田(土壤总Cd含量≤1.5 mg/kg)种植;在水稻生长中后期,特别是对有效磷严重缺乏的田块,应结合病虫害防治喷施磷酸二氢钾,以促进壮籽增产;除种子公司提供高纯度种子和大田生产要注意田间除杂外,即便是镉低积累常规稻品种,也不建议农户自留种,以免因种子纯度问题造成稻谷Cd超标。

M1TDS技术及镉低积累杂交水稻亲本创制与组合选育

"镉大米"问题是当下中国南方水稻产业发展急需解决的重大问题,培育镉低积累水稻品种是解决该问题最直接、最经济的方法。本研究开发了一项高通量靶向鉴定理化诱变M1代突变及获取突变体的技术(M_(1) generation targeted deep sequencing technology,M_(1)TDS技术)。利用M_(1)TDS技术,从重离子诱变M_(1)代材料中获得了镉转运蛋白基因OsNramp5嵌合突变体,并在M_(2)代获得了OsNramp5纯合突变不育系莲1S和恢复系R001。用R001与莲1S配制成的杂交稻组合莲两优1号,在有效镉含量0.443mg/kg、pH4.93的污染田进行种植鉴定,莲两优1号籽粒镉含量稳定在0.03mg/kg以下,远低于对照品种臻两优8612(0.38 mg/kg)的籽粒镉含量和国家限量标准值0.20 mg/kg。本研究不仅为解决"镉大米"问题提供了重要的新种质,且突破了理化诱变M_(1)代嵌合突变体难以高通量鉴定的技术瓶颈,为水稻及其他作物提供了一种理化诱变定向改良的共性新技术。

籼稻低亲和阳离子转运蛋白基因OsLCT2的克隆与生物信息学分析

OsLCT1是目前在水稻中唯一鉴定出来的参与韧皮部镉离子运输的关键转运蛋白,与水稻籽粒镉积累密切相关。本研究根据Gene Bank已发表的小麦Ta LCT1基因序列信息设计引物,利用RT-PCR方法从籼稻93-11和华占中克隆了低亲和阳离子转运蛋白基因(LCT),并命名为OsLCT2。生物信息学分析结果表明,该基因定位在5号染色体上,全长2 699 bp,包含3个外显子和2个内含子,其CDS全长1 437 bp,编码478个氨基酸,包含2个PEST序列和11个跨膜结构域。OsLCT2蛋白二级结构预测显示,α-螺旋占57.11%、β-折叠占7.74%,无规则卷曲占35.15%。序列比对和系统进化树分析结果表明,OsLCT2与小麦的亲缘关系最近达65%,其次为高粱64%,而与水稻OsLCT1的同源性并不高,推测OsLCT2的功能可能与Ta LCT1相类似。

利用CRISPR/Cas9技术创制镉低积累香型水稻

尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对镉吸收转运基因OsNramp5和香味基因OsBadh2同时进行编辑,培育出后代性状稳定的优质低镉水稻品种。选用华南地区推广面积较大的常规稻华航31为受体材料,通过CRISPR/Cas9技术创制OsNramp5和OsBadh2双基因敲除植株,在镉污染土壤中种植并测定野生型和双基因敲除植株糙米的镉、锰、铁元素含量以及香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量,并考察野生型与双基因敲除植株的农艺性状。成功获得了5种类型的华航31双基因敲除植株。与野生型华航31相比,大部分双基因敲除植株的镉和锰含量显著下降,铁含量有一定程度的升高;所有双基因敲除植株中的香味物质2-AP含量均显著提高;大部分双基因敲除植株的株高、每穗实粒数显著下降;全部双基因敲除植株的单株有效穗数、每穗总粒数、结实率均无显著变化。通过CRISPR/Cas9技术可快速创制具有镉低积累和香味的水稻种质,有利于加快优质、安全水稻品种的育种进程。

水稻矮秆多分蘖突变体htd(t)的遗传分析与基因定位

在粳稻品种中花11的组培苗中发现1份可以稳定遗传的矮秆多分蘖突变体,相比野生型,突变体株高明显下降、分蘖能力明显增强。为定位控制该性状的基因,以该突变体和野生型杂交构建遗传群体,与籼稻黄华占构建定位群体,再利用SSR和In Del分子标记定位该基因。遗传分析表明,矮秆多分蘖突变体受1对隐性核基因控制,暂命名为htd(t)。利用F2代定位群体将突变基因定位于第4号染色体标记RM1345和ZM4-12之间,遗传距离分别为3.9和2.6 c M。序列分析表明,htd(t)可能为HTD1的等位基因。

水稻中胚轴伸长机制研究进展

水稻中胚轴是胚芽鞘节与胚根着生点之间的部分,中胚轴伸长是直播水稻出苗的重要特征。从遗传背景、直播条件、植物激素、细胞结构、基因定位等方面综述了水稻中胚轴伸长机制的研究进展,为直播稻品种的选育和应用提供参考。

高粱稻GLR与受体9311的遗传多态性比较

采用"穗茎注射法"将高粱BTx623基因组DNA导入超级杂交稻亲本9311,获得了高着粒密度的大穗变异系"高粱稻"GLR。用225对In Del分子标记对原始变异株及其自交3代株系与供体和受体进行多态性检测,发现两者与受体9311相比分别有20.4%和10.7%的多态位点,并在原始变异株及其自交3代株系中发现受体9311不存在而与供体高粱同源的片段,从分子水平证明了供体高粱DNA片段向受体水稻基因组的转移。比较分析5个已克隆的穗部性状相关基因在变异系与受体9311中的多态性,发现DEP3、D1和Gnla 3个基因共存在35个SNP和6个In Del,其中9个SNP和2个In Del位于外显子。

水稻颖花畸形突变体(gm(t))的遗传分析与基因定位

在籼稻‘绵恢523’בR8117’的F5世代15C197群体分离出颖花变异突变体,表现为内稃退化、发育迟缓或发育成外稃状、颖壳畸形不闭合,暂命名为颖花畸形突变体(glume malformation,(gm(t))。以该突变体gm(t)与粳稻02428杂交构建F2定位群体,利用图位克隆技术对gm(t)进行初步定位。结果表明gm(t)突变体的颖花畸形性状受单隐性核基因控制,初步将gm(t)定位在水稻第6号染色体上,标记ZM506 (1.254 Mb)与RM3463(2.110 Mb)之间,两个标记间的物理距离约为856 kb。检索该区间发现含有内颖形成调控基因DP1(LOCOs06g04540)。gm(t)的穗部表型与dp1突变体很相似。为此,对15C197野生型和gm(t)突变体的DP1基因进行比较分析,发现gm(t)突变体在该基因编码区有一段19 bp的缺失,会引起移码突变。因此推测gm(t)即为DP1基因的等位突变基因。gm(t)为研究水稻外轮花器官发育特性及相互转换的内在分子机制提供新的种质资源。