大型纤毛虫总RNA的提取方法

以冠突伪尾柱虫为材料 ,建立了一种适合于富含RNase和多糖的大型纤毛虫总RNA的提取方法。该方法采用异硫氰酸胍和 β 巯基乙醇联合快速变性 ,酚、氯仿和异戊醇抽提 ,同时在变性剂存在的条件下两次选择性地沉淀RNA ,从而有效地去除了DNA、蛋白质和多糖。所得RNA样品经电泳、紫外分光光度法检测和RT PCR分析 ,证实为完整、均一且无基因组污染的总RNA。这为构建冠突伪尾柱虫有小核系与无小核系之间的削减文库、筛选两细胞系差异表达的基因奠定了基础。

筛选冠突伪尾柱虫有小核细胞系和无小核细胞系饥饿期差异表达的ESTs

利用显微切割的方法建立大型腹毛目纤毛虫———冠突伪尾柱虫(Pseudourostyla cristata)的无小核细胞系,分别提取有小核和无小核细胞系的总RNA,用SMART-PCR方法直接合成dscDNA,进而运用抑制性消减杂交技术(Sup-pression subtractive hybridization,SSH)对冠突伪尾柱虫去小核前后的差异表达基因进行研究,构建了有与无小核细胞系在饥饿期差异表达基因的消减文库,随机挑取了284个克隆,应用cDNA阵列技术鉴定阳性克隆。将鉴定出的17个阳性克隆进行Blastx分析,结果表明17个EST(Expressed sequence tag)均可能与小核体功能密切相关,此为进一步阐明小核的遗传机理奠定了基础。