重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子溶瘤2型单纯疱疹病毒注射液(Vero细胞)的药效学分析

目的分析重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)溶瘤2型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)的体内、外药效。方法按不同感染复数(MOI)=0.002、0.01、0.05、0.25、1.25分别感染人结肠癌细胞(Lo Vo)和人喉癌细胞(Hep2),MTT法检测OH2在体外的溶瘤作用。经BALB/c-nu正常小鼠右侧肋腹皮下分别注射Lo Vo细胞和Hep2细胞,当肿瘤平均体积>100 mm^3时,试验组于肿瘤内分别注射高、中、低剂量的OH2(1×10~7、1×10~6、1×10~5 CCID_(50)/m L),同时设阳性对照组(5 mg/m L的5-FU)及阴性对照组(DMEM/F12培养基),于第0、3和6天进行注射。首次注射后第0、3、6、9、12、15、18天测量肿瘤长径(a)和宽径(b),计算肿瘤体积(tumor volume,TV)及相对肿瘤增殖率。结果 OH2在较小浓度下(MOI分别为0.168和0.063)即可较好地杀伤Lo Vo和Hep2细胞。与阴性对照组比较,两种肿瘤模型的OH2高、中、低剂量组及阳性对照组均有显著抑瘤效果(P<0.05);Lo Vo肿瘤模型中,OH2高剂量组的抑瘤效果明显优于中、低剂量组(P<0.05);Hep2肿瘤模型中,OH2高、中、低剂量组的抑瘤效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 OH2在体外和体内实验中均显示较好的溶瘤作用,具有新生物药开发前景,为临床前研究提供了实验依据。

人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(OH2)生物学特性的稳定性

目的分析人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)生物学特性的稳定性。方法将OH2在Vero细胞中连续传20代,测定不同时间点收获的不同代次(P4、P10、P20)病毒的滴度,并绘制病毒的生长曲线;ELISA夹心法检测表达的h GM-CSF的含量;TF-1细胞培养法检测表达的h GM-CSF的活性;CCK-8试剂盒检测OH2的体外癌细胞杀伤能力。结果 OH2在Vero细胞中连续传20代后,不同代次病毒(P4、P10、P20)的生长曲线模式、表达的h GM-CSF含量及活性、体外癌细胞的杀伤能力均无明显差异。结论 OH2生物学特性的稳定性良好,具有新生物药开发前景。

重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒纯化工艺的建立

目的建立重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simple virus typeⅡ,o HSV2)OH2纯化工艺,制备高纯度的病毒。方法采用不同粗滤材质[PDH4囊式过滤器、Bio20囊式过滤器、Ultipor GF U6-40、PP材质滤膜(聚丙烯膜)和CA材质滤膜(醋酸纤维膜)]澄清过滤后,使用不同的层析柱(Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱和Capto^(TM) Core 700)进行纯化,并根据确定的纯化工艺,进一步放大层析柱体积。依据病毒滴度的变化,选择合适的纯化工艺条件。结果 PP及CA材质滤膜过滤病毒液后滴度变化较小,二者对病毒吸附较低;Mustang Q、Sartobind Q囊式离子交换柱纯化OH2病毒时收率最高为13%,而Capto^(TM) Core 700在AKTA仪上纯化高滴度的病毒液时几乎不损失病毒;使用Capto^(TM) Core 700进行柱体积放大后,柱床直径为26 mm时,纯化后病毒的滴度及收率较理想。结论使用CA膜过滤细胞裂解液后,采用Capto^(TM) Core 700进行柱层析,可制备高纯度的OH2。