基于启动子和信号肽优化提高谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

【背景】谷氨酰胺酶(glutaminase)是一种能够催化L-谷氨酰胺水解生成L-谷氨酸和氨的酶,在食品、医药等领域有重要的应用价值。【目的】研究不同启动子和信号肽对谷氨酰胺酶分泌表达的影响、构建能高效分泌表达谷氨酰胺酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株,提高谷氨酰胺酶的产量。【方法】选用枯草芽孢杆菌SCK6作为表达宿主,构建带有不同启动子和信号肽的谷氨酰胺酶表达载体及重组菌株,分析不同基因元件对谷氨酰胺酶表达及分泌的影响,筛选最优启动子和信号肽,组合优化,构建高效分泌表达谷氨酰胺酶的工程菌株。【结果】实现了谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,在以P_(HpaII)-P_(aprE)为启动子、YndA为信号肽的条件下,摇瓶发酵胞外最高酶活达到6.7U/mL。【结论】通过对启动子、信号肽关键基因元件进行筛选组合,构建了一株高效分泌表达谷氨酰胺酶的菌株,为酶的高效分泌表达提供了一种有效的方法。

γ-谷氨酰转肽酶在枯草芽孢杆菌中高效表达及发酵培养基优化

γ-谷氨酰转肽酶是一种能催化底物谷胺酰胺形成γ-谷氨酰-酶复合体,再被受体底物(如氨基酸、短肽)亲核取代,发生转肽反应形成γ-谷氨酰肽的酶,在食品、医药等领域有重要应用价值。该研究选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6作为表达宿主,以来源于枯草芽胞杆菌的173种信号肽为基础构建γ-谷氨酰转酶信号肽筛选文库,筛选出最优信号肽SP_(cotC),在此基础上进行启动子筛选,得到最优启动子P_(aprE),最终构建了一株高效分泌表达γ-谷氨酰肽酶的重组菌株BS-gts3,摇瓶发酵胞外酶活力最高为5.04 U/mL。通过单因素试验和响应面试验筛选出最优培养基:乳糖31.73 g/L、FM80250.26 g/L、硫酸镁1.24 g/L、KH_(2)PO_(4)1.25 g/L、K_(2)HPO_(4)0.75 g/L,胞外酶活提高了12%,为5.623 U/mL。并进行5 L发酵罐放大培养,在38 h,胞外酶活力达到最高28.18 U/mL,是已报道的最高水平。该研究对γ-谷氨酰转肽酶的产品开发及应用奠定了基础。