IBV安徽分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

利用设计的1对特异性引物，通过RT-PCR方法扩增出4株鸡传染性支气管炎病毒（my）安徽地方分离株膜蛋白M基因全长片段并进行了克隆测序。将各IBV安徽地方分离株与GenBank中注册的一些毒株M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较和系统进化关系分析，发现毒株间核苷酸序列同源性为88．5％～100％，其相应的氨基酸序列同源性为90．3％～100％；不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异，从ATG至第140bp区段的核苷酸序列变异频率最高；4株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群，与我国常用疫苗毒株H120、M41和W93不属同一个进化亚群。

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。

种鸡鸡白痢血清学调查

2007年12月笔者对安徽省宣城地区7个鸡场的种鸡随机抽取血样992份,采用血清平板凝集试验进行鸡白痢抗体检测,结果表明,该地区种鸡群鸡白痢阳性率为10.9%,其中公鸡阳性率为11.2%,母鸡阳性率为10.6%,表明该地区鸡群中鸡白痢的感染率较高,已成为危害当地养鸡业的重要疾病之一。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫效力研究

研究使用健康易感仔猪对3批猪支原体肺炎活疫苗(168株)分别进行了免疫效力试验、免疫期试验、临床效力试验、同类制品的免疫效力比较试验和免疫期比较试验,以及5批疫苗免疫商品猪的临床试验。结果表明:猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫仔猪60 d后,免疫组有80%以上的保护率,免疫后7个月,试验组仍有50%以上的保护率;同类制品免疫效力和免疫期比较试验结果表明两种猪支原体活疫苗差异不明显。临床观察和病理剖检结果表明免疫保护率在85%以上。以上结果都说明猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有很好的免疫效力。

Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分子克隆及序列分析

采用RT-PCR法对Ⅰ型DHV A66弱毒株基因组全序列进行了分子克隆与测序。研究结果表明,不含Poly(A)尾巴的A66株的基因组全长为7 704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区、6 750个核苷酸残基的开放阅读框和314个核苷酸残基的3′非编码区。应用分子生物学软件将A66株与GenBank公布的其他DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果表明,除了90D和04G两株变异株外,A66株ORF的核苷酸序列与其他各株的同源性在94.3%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%之间,并且A66与C80、JX弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,在99.4%以上,各毒株氨基酸序列同源性比核苷酸同源性略高。Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增DHV-I(A66株)VP1基因。用限制性内切酶EcoRⅠ/HindⅢ消化VP1基因和转移载体pFastbacⅠ,在T4DNA连接酶作用下将二者连接构建转移质粒pFastbac-VP1。经PCR、双酶切及测序鉴定后将其转化至含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10bac中,蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP1,在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf 9,获得重组杆状病毒rvBac-VP1。SDS-PAGE分析结果表明,VP1基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物分子量约为2.7×104。Western-blot检测结果表明,表达产物能与抗DHV-I阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物回归试验和血清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV。采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析。结果表明,分离株HeNan10/08与B J株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%。

樱桃谷鸭葡萄球菌病的诊治

近年来,随着养鸭业的规模化、集约化程度的不断提高,鸭葡萄球菌病已成为严重危害养鸭业的传染病之一。我们对安徽省部分地区送检的疑似为患葡萄球菌病的樱桃谷鸭进行了流行病学调查和实验室诊断,最终确诊为鸭葡萄球菌病。并分别对6株分离的致病性菌株选用10种抗生素进行药敏试验,根据药敏试验结果,选用高敏药物给不同患病鸭群进行治疗,取得了较满意的效果。

安徽省部分地区禽波氏杆菌病的血清学调查

从2006～2007年对安徽合肥、六安、巢湖、安庆、淮南、阜阳、滁州、芜湖、蚌埠等9个地区的163群禽中出现拉稀的病禽采取血清样品326份,进行波氏杆菌病抗体检测。结果,在326份禽血清样品中检出阳性79份,阳性率为24.23%,并对不同品种、日龄、地区的禽波氏杆菌病的感染率进行统计。统计表明,禽波氏杆菌病在安徽部分地区的禽群中流行相当严重。

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。

鸡传染性贫血病毒与禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法的建立

当前养鸡业中鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒混合感染的发生率日益增高,为提高CIAV、REV检测效率,根据GenBank上登录的CIAV全基因序列和REV的LTR序列分别设计了2对引物,建立了REV、CIAV二重PCR检测方法,另外还比较了2种不同的DNA提取方法。结果显示,该方法扩增目的条带清晰、敏感性高、特异性好。应用建立的方法对临床7份病料样品检测,检出5份CIAV、REV阳性,表明建立的二重PCR方法能有效用于CIAV、REV混合感染的临床诊断。

鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列(AY228555),运用Primer Premier 5.0设计2对引物,建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法,采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示,套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍;表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭圆环病毒(DuCV)感染的临床诊断和流行病学调查。

一例猪流行性腹泻病的诊断与治疗

根据分泌型IgA抗体出现规律,对发病母猪进行灭活疫苗和弱毒疫苗交替免疫,是防控腹泻复发的关键措施。

鸡滑液囊支原体病研究进展

鸡滑液囊支原体可引起鸡滑液囊炎,该病是鸡的一种急性或慢性传染病,以侵害关节滑液囊膜及腱鞘为主,引起关节渗出性滑膜炎、腱鞘炎及跗关节和脚掌肿胀。本文就鸡滑液囊支原体病的病原学特点、流行病学、临床症状、病理变化、诊断方法和预防治疗措施进行综述。

一起规模化猪场的猪伪狂犬病诊治

伪狂犬野毒感染发病率上升,一与伪狂犬病毒基因出现了变异有关;二与免疫程序和疫苗不对称有关;三与引进种、配种时没有进行严格的g E抗体筛选有关;四与猪场消毒、隔离措施不严有关。2015年6月河源市某规模化猪场妊娠后期的母猪开始出现流产,7月份产房少数母猪产的仔猪出现神经症状、腹泻和整窝仔猪死亡,7月份中大猪呼吸道疾病增多和出现神经症状。根据发病情况、病理剖检、

禽巴氏杆菌Pm-HB株的分离与鉴定

湖北省某鸡场疑似巴氏杆菌(Pasteurella)感染,从送检病鸡的肺脏和肝脏中分离到1株细菌,通过菌落形态、培养特性、生化试验、16SrRNA序列比对鉴定为禽多杀性巴氏杆菌,并命名为Pm-HB株。动物回归试验表明,10CFU细菌即可100%致死30日龄SPF鸡,可确诊为巴氏杆菌病。

番鸭源鸭肝炎病毒CH12株的分离与全基因组序列分析

从浙江省某疑似鸭病毒性肝炎的发病番鸭群分离到1株鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)CH12株,分离毒株经动物回归试验、ELD50测定、中和试验等确定为DHV-1(基因A型DHV)。通过RT-PCR方法对DHV CH12株的全基因组序列进行分段扩增并测序。结果表明,CH12株的全基因组长度为7690 bp(不包括PolyA),包括626 bp的5′UTR,6747 bp的ORF和317 bp的3′UTR。CH12株各基因均与基因A型DHV毒株的序列相似性较高,与基因B型和基因C型DHV毒株的序列相似性较低。全基因组核苷酸、多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因的进化分析均显示,CH12株均与基因A型DHV在同一进化分支上,亲缘关系较近,属于基因A型DHV。