禽流感新型疫苗研究进展

禽流感是由A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,家禽、野鸟和部分哺乳动物均可感染。禽流感给中国养殖业造成了巨大的损失,同时,随着病毒的种间传播,人类的生命安全也受到了严重威胁。目前,疫苗免疫仍是防控禽流感最主要的手段,传统的疫苗主要有鸡胚灭活苗和禽流感弱毒疫苗。虽然在过往几次禽流感暴发过程中,传统疫苗发挥了重要作用,但其自身却存在诸多弊端,因此研制新型疫苗来弥补传统疫苗的不足是很有必要的。文章主要对禽流感重组活载体疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒样颗粒疫苗等新型疫苗的研究进展进行综述,旨在为禽流感的防控提供参考。

鸡病毒性关节炎疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)可引起鸡病毒性关节炎(Avian Viral arthritis,AVA)疾病,主要侵害关节滑膜、腱鞘和心肌,引起足部关节肿胀、腓肠腱断裂、跛行,是鸡的重要传染病之一。目前预防鸡病毒性关节炎(AVA)最有效的方法仍是疫苗接种,因此禽呼肠孤病毒(ARV)疫苗的研发意义非常重大。目前市场上已有许多ARV弱毒及灭活商品疫苗,对于ARV基因工程疫苗也有许多学者正对其研究。现对近几年ARV疫苗的研究进展做如下综述。

禽呼肠孤病毒动物感染模型的建立

本试验旨在建立鸡病毒性关节炎动物感染模型,为疫苗效力检验奠定基础。试验采用禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)AV2311强毒株和ARV T98强毒株,分别以102.0、103.0、103.5、104.5和105.5 ELD50/0.2mL剂量感染49日龄SPF鸡,感染后观察10d,每天观察、检查接种鸡足垫、小腿或跗关节的肿胀、跛行及红肿情况,于感染后6d采血,感染后10d剖检,应用ELISA检测方法测定血清抗体。结果显示,105.5和104.5 ELD50/0.2mL感染剂量鸡发病率均达100%,鸡足垫肿胀严重,呈暗红色或紫色,AV2311株症状稍轻于T98株;103.5 ELD50/0.2mL感染剂量鸡发病率为90%,103.0和102.0 ELD50/0.2mL感染剂量鸡发病率为80%。ELISA检测结果显示,2毒株104.5和105.5 ELD50/0.2mL感染剂量血清抗体均为阳性。试验结果表明,ARV T98株毒力强,具有好的免疫原性,最佳感染剂量为104.0 ELD50/0.2mL,为鸡病毒性关节炎疫苗质量标准的研究提供了重要依据。

4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV),分别为河北株(HB)、湖北株(HUB)、山东株(SD)、山西株(SX)。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S(aa 326S-332S),其222(A)、256(I)、294(I)和299(S)位是传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S(aa 326S-332S),其222(P)、256(V)、294(L)和299(N)位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。

兽用疫苗的风险分析

疫苗作为一种特殊的产品,具有生产操作精细、工艺复杂、周期长、对生产环境要求高的特点,企业为提高产品质量,降低意外损失,确保公司正常运营,会对疫苗研发、生产、质控、应用的整个生命周期进行风险管理,其中疫苗的生产和质控环节尤为重要,

鸡传染性喉气管炎病毒适应性细胞的筛选

为了克服鸡传染性喉气管炎弱毒活疫苗产品制备中存在的缺陷,通过对BHK-21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞(CEF)、原代鸡胚肝细胞、原代鸡胚肾细胞等六种细胞进行病毒适应性培养,采用PCR和免疫荧光(IFA)跟踪检测的方法成功筛选出具有稳定病毒滴度的病毒适应性细胞——鸡胚肝细胞。然后采用新的克隆方法缩短了克隆时长并对筛选的鸡胚肝细胞进行克隆纯化,通过与原代鸡胚肝细胞进行比较,结果显示本试验所采用的克隆方法具有高几率的特点,并且能够克隆出高活性的鸡胚肝细胞,并能够繁殖较高效价的鸡传染性喉气管炎病毒,为解决鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗在生产上存在的瓶颈问题提供了重要的基础条件。

副猪嗜血杆菌病的综合防控

副猪嗜血杆菌病（HPS）又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，又称猪格拉瑟病（Glasser’Sdisease），临床七以体温升高、关节肿胀、呼吸阑难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征。副猪嗜血杆菌在一定的因素影响下会激发为致病菌，引起副猪嗜血杆菌病的发生，此菌只感染猪，感染呈地方性流行，主要通过呼吸系统传播，主要危害仔猪和青年猪，

重组猪乳铁蛋白N端的高效表达及抑菌活性检测

为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株,并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性,应用RT-PCR方法从泌乳3d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077bp的PLF-N基因片段,与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比,核苷酸同源性均达到99%以上。为了得到高表达量的PLF-N基因,以扩增的PLF-N片段为参考模板,经过密码子优化,全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中,转化大肠杆菌BL21,获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21;经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为42kDa,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32%,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98%。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达,是一种提高表达效率的有效手段。

鸡病毒性关节炎疫苗的研究进展

鸡病毒性关节炎（AvianViralarthritis，AVA）是由禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV）引起鸡的一种以关节炎、腱鞘炎等为特征的重要传染病。1957年美国学者Olson等首次报道了此病，1959年他们利用从鸡关节内分离到的1株病毒成功地复制了关节炎病例，命名为鸡病毒性关节炎。目前在全世界多数国家均有该病发生，并分离出不同的禽呼肠孤病毒株。

鸡病毒性关节炎灭活疫苗与同类产品比较研究

鸡病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒（ARV）引起鸡和火鸡的一种以关节炎、腱鞘炎、吸收障碍为特征的免疫抑制病。该病毒主要感染2周龄的雏鸡，感染率可达100％，发病率为5％～20％，死亡率为12％-15％不等。