多基因同步调控结合高通量筛选构建高产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

L-苯丙氨酸(L-Phe)是重要的食品及医药中间体,但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂,仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造,难以实现各个模块之间的通量平衡,在一定程度上限制了其产量的进一步提升。本研究将L-Phe生物合成途径中的7个携带组成型启动子PF11及核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroF^(fbr)、aroE、aroL、pheA^(fbr)和tyrB,整合到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组中;利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术(base editor-targeted and template-free expression regulation,BETTER),对每个关键基因的RBS进行同步编辑,生成富含G/A的RBS突变文库;利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统(droplet microfluidics)对RBS突变文库进行高通量筛选。最终,从大约7万个RBS突变文库中筛选到4株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株,其72 h摇瓶发酵产量分别为2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L,相比对照菌株C.g-2(0.6 mmol/L)分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40倍。利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库,可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展

以同源重组、CRISPR等为代表的遗传操作技术是合成生物学的重要支撑技术。高效准确的遗传操作依赖于可准确定位编辑位点和实现序列改造的编辑序列(如引物序列、同源臂序列、sgRNA序列等)。由于遗传改造目标与遗传操作技术丰富多变,加之近年来基于生物铸造厂(BioFoundry)的自动化遗传改造模式对高通量设计的需求日益增加,使得通过计算机辅助设计工具实现精准快速的编辑序列设计愈发重要。本文针对不同阶段实现不同目标的微生物遗传操作技术和相应的编辑序列辅助设计工具的发展进行了综述。按照不同编辑序列类型和遗传操作应用场景,将编辑序列设计工具划分为四种类型:引物设计工具、DNA组装的设计工具、sgRNA设计工具、基因组编辑的全流程设计工具,对各类编辑序列设计工具的应用及存在的问题进行了分析总结并对未来的研究方向进行了展望。编辑序列设计工具的发展将有助于实现合成生物学“设计—构建—测试—学习”(designbuild-test-learn,DBTL)工作循环中上游的基因型“设计”与下游“构建”两个关键环节之间的无缝衔接。

生物法生产3-羟基丙酸研究进展

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)是一种具有末端羟基与羧基双活性基团、应用广泛的有机酸,生物法合成3-HP具有高效、绿色、可持续发展等优势。本文分析了生物法生产3-HP的主要合成途径、主要生产菌种及菌株改造、发酵工艺优化3个方面的研究进展。重点介绍了以甘油合成途径、丙二酰辅酶A合成途径、β-丙氨酸合成途径为代表的主要合成途径及相应途径的关键酶;以克雷伯氏肺炎球菌、酵母菌及大肠杆菌为代表的主要生产菌株及其改造策略;包括分批发酵、两阶段发酵及固定化细胞催化等在内的发酵工艺优化策略3个方面的研究内容。最后指出了进一步筛选改造甘油脱水酶等途径的关键酶;基于先进基因组编辑技术开发的非致病性、3-HP高耐受型菌株,挖掘新的3-HP合成途径;开发更加经济、高效、环保的发酵工艺路线,将是今后生物法生产3-HP的研究重点。

生物法合成双乙酰的研究进展

随着对双乙酰生物合成途径的深入研究,利用代谢工程的方法定向改良菌株,优化双乙酰的代谢途径,成为提高双乙酰生产水平的新思路。本文总结了双乙酰的生产菌株和相关代谢途径,综述了改造双乙酰生产菌株的代谢工程策略,提出了未来的研究方向。

麦角硫因生物合成研究的新进展

麦角硫因是一种独特的细胞生理保护剂,在食品、饮料、化妆品和医药等行业具有广阔的应用前景。生物合成法是麦角硫因制备方法的研究热点。文中介绍了近年来在麦角硫因生物合成途径的鉴定、生物合成关键酶的挖掘、天然可食用菌种以及高产工程菌的开发等方面取得的新进展,以期从分子层面深入认识麦角硫因生物合成的调控机制,进而利用发酵工程、代谢工程和合成生物学的新技术大幅度提升麦角硫因的生物合成水平。

工程菌种自动化高通量编辑与筛选研究进展

合成生物学(synthetic biology)与经典生物学研究的革命性区别之一是合成生物学能将生物实验的对象、方法、技术和流程高度标准化和模块化,创建出自动化与高通量的合成生物铸造模式。该模式通过复杂生物过程与自动化设施的结合,颠覆过往劳动密集型的研究范式,获得更高的技术迭代能力,极大促进了合成生物学的发展和产业化应用。值此天津工业生物技术研究所创立10周年之际,本文回顾了研究所在工业菌种自动化高通量编辑与筛选领域的系列重要工作进展,对基因克隆(gene cloning)、基因组编辑(genome editing)、编辑序列设计(editing sequence design)等生物技术的自动化实现,以及流式细胞、液滴微流控、全基因组规模扰动测序等高通量筛选技术进行了分析讨论,并展望了本领域未来的发展方向。望借此为创建具有自主知识产权的优秀菌种及其产业应用提供智能化、自动化和全链条覆盖的整体支撑能力。

乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响

【目的】研究乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响。【方法】在谷氨酸棒杆菌CGF2中异源表达als SD操纵子构建乙偶姻生产菌株CGT1,考察敲除乙酸生成途径cat和pqo对乙偶姻的影响。然后引入短乳杆菌的NADH氧化酶,在优化的溶氧条件下研究其对乙偶姻产量的影响。【结果】CGT1在摇瓶发酵中可积累6.27 g/L乙偶姻,敲除cat使乙偶姻产量显著提高30.94%,达到8.21 g/L;双敲除cat和pqo没有进一步提高产量。通过优化发酵的溶氧水平,乙偶姻产量达到10.06 g/L。在高溶氧水平下引入NADH氧化酶导致菌株的生长和糖代谢速率提高,但乙偶姻产量略有降低。在分批补料发酵中,重组菌株乙偶姻产量达到40.51 g/L,产率为0.51 g/(L?h)。【结论】在谷氨酸棒杆菌中阻断乙酸合成途径cat能够有效提高乙偶姻产量,NADH氧化酶在高溶氧水平下表达不利于乙偶姻的合成,需要进一步调节表达水平以确定其效果。