塞内卡病毒多克隆抗体的制备及其在免疫组织化学中的初步应用

为了制备纯度高、特异性强的塞内卡病毒(SVA)多克隆抗体并研究其在免疫组织化学(IHC)中的应用,本试验用甲醛溶液灭活SVA,将其与矿物油佐剂充分混合乳化后,接种兔制备多克隆抗体并测定中和抗体效价,经Protein A亲和层析介质纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度,用斑点杂交法(Dot blot)鉴定抗体特异性;以该抗体作为一抗,应用IHC技术检测SVA感染猪的蹄部组织切片中抗原的表达情况。结果显示,制备的SVA多克隆抗体中和抗体效价为1∶1024,纯化后的抗体经SDS-PAGE鉴定仅有分子量约55 kDa和25 kDa两条目的蛋白条带;Dot blot结果显示,该抗体特异性强,最低检测浓度为0.15μg/mL;IHC结果显示,该抗体在1∶500稀释时能够检测到组织切片中抗原的表达。结果表明,本试验制备的SVA多克隆抗体符合IHC技术要求,可为下一步SVA致病机理研究提供重要的试验材料。

禽腺病毒-Ⅰ群PCR-RFLP分型方法的建立

为快速确定临床禽腺病毒-Ⅰ群(FAdVs)的血清型,本研究根据FAdVs的Hexon基因设计引物,对12个血清型FAdVs标准毒株进行PCR扩增,并根据扩增目的片段进行酶切位点分析和相应酶切反应研究,建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。结果显示,利用该引物可同时扩增12个血清型FAdVs标准毒株,扩增片段大小为894 bp;扩增片段酶切位点分析显示,Eco130Ⅰ、Pf123Ⅱ、MluⅠ、PsyⅠ和BgⅡ为主要酶切位点,这5种酶切反应结果显示12个血清型FAdVs标准毒株可以得到不同的酶切图谱,且能区分12种血清型FAdVs;应用该酶切方法对本实验室保存的2株已知血清型的分离株进行分析,其结果与已确定的血清型一致。表明本试验建立的PCR-RFLP方法简便、特异性和区分度好,可用于12个血清型FAdVs的分型。

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10^5拷贝/μL、8.93×10^2拷贝/μL和2.11×10^4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。

我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行血清型hexon蛋白序列分析及抗原表位预测

为了解我国Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)主要流行血清型hexon蛋白序列和抗原表位的差异,对43株FAdV-Ⅰ分离株的hexon进行了序列和遗传进化分析,利用DNAStar中Protean预测了4个流行血清型代表株hexon蛋白的抗原表位。结果显示:同型分离株间hexon氨基酸序列同源性高,其中FAdV-4分离株的氨基酸序列同源性为100%。hexon蛋白氨基酸序列在第132～289位、第363～507位和第793～878位存在3个主要可变区,分别对应于hexon的L1、L2和L4区。在FAdV-11中,分离株QDPD100808和YTLY081010氨基酸序列在第97-138位区段发生缺失,分离株HNQX120913在第693-720位突变为HVQEHERALRHVHQLARERPVASTQPVS。预测到FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的代表株hexon蛋白分别有40、37、38和37个抗原表位,FAdV-4的特异性抗原表位最多,为16个,FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11特异性抗原表位较少,分别为3个、6个和3个。研究结果为我国FAdV-Ⅰ主要流行血清型基于hexon基因的诊断提供了理论依据。

我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行血清型间交叉中和作用的初步研究

为了解我国Ⅰ群禽腺病毒（FAdV-Ⅰ）主要流行血清型FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11之间的交叉中和情况,试验选取4种流行血清型的代表株,制备其对应的血清型单因子血清并进行细胞交叉中和试验。结果表明：4种血清型都能对自身病毒产生中和作用,其中RZ140718（FAdV-4）血清还能中和YT160809（FAdV-11）,JL150226（FAdV-8b）和YT160809（FAdV-11）之间还能互相中和。说明FAdV-Ⅰ不同流行血清型间交叉中和情况复杂。

我国主要流行的4种血清型禽腺病毒-Ⅰ群感染SPF鸡的致病性比较研究

旨在对我国流行的4种血清型(4、8a、8b和11型)禽腺病毒-Ⅰ群(fowl adenovirus,FAdVs)对鸡胚和鸡的致病性进行研究,选取12日龄SPF鸡胚和10日龄SPF鸡感染4种血清型FAdVs,对SPF鸡胚和鸡的死亡率及鸡胚胚体质量进行统计;对感染鸡的大体剖检变化、组织学变化进行观察和病毒载量进行研究。结果显示,FAdV-8b和FAdV-11感染SPF鸡胚后其死亡率高于45%,FAdV-8a感染后胚体质量降低最严重,FAdV-4感染后对胚体质量影响最小;FAdV-4感染SPF鸡死亡率高达53.3%,其他组鸡无死亡;除肝出现肿胀、变性、出血和炎性细胞浸润外,4种病毒感染SPF鸡后分别造成不同组织器官的严重损伤,FAdV-4感染出现心包积液、FAdV-8a感染肌胃出现糜烂、FAdV-8b感染导致腺胃肿胀和FAdV-11感染导致胰腺坏死,各损伤组织均出现实质细胞坏死和炎性细胞浸润;4种病毒感染SPF鸡均出现免疫器官的组织学损伤,其中,FAdV-8a、-8b和-11感染鸡引起的免疫器官内淋巴细胞缺失和损伤较FAdV-4更为严重;组织病毒载量结果显示,FAdV-4感染鸡心和肾病毒载量最高,FAdV-8b和FAdV-11感染鸡胰腺病毒载量高于FAdV-4感染组,且FAdV-4感染鸡心、肝和肾病毒载量在感染后第5天高于第3、7天,除FAdV-8a感染组外,病毒载量与各组织损伤情况相一致。综上表明,4种血清型FAdVs中,FAdV-11对SPF鸡胚的致死性最强,FAdVs对SPF鸡的致死率最高,尽管FAdV-8a、-8b和-11不致死SPF鸡,但对SPF鸡胚、SPF鸡的消化系统和免疫系统损伤较为严重,这将会造成鸡胚孵化率降低、鸡生长发育缓慢和易于继发其他病原感染。

滴鼻免疫疫苗对SPF鸡气管功能影响的研究

为研究疫苗滴鼻免疫对鸡气管功能的影响,本研究对SPF鸡滴鼻免疫新城疫疫苗后气管纤毛摆动速率、气管形态结构和黏液分泌进行了研究。80只7日龄SPF鸡随机分为对照组和试验组,每组40只,试验组SPF鸡滴鼻免疫新城疫弱毒疫苗,对照组滴鼻生理盐水;于免疫后的第0、2、4和6天,每组每次随机剖杀10只鸡,应用红细胞示踪法测定气管纤毛摆动速率,采集气管制备石蜡组织切片进行HE和奥新蓝pH 2.5和pH 1.0染色。结果发现,疫苗免疫后的第0和2天试验组SPF鸡纤毛摆动速率较对照组升高,但差异不显著(P>0.05);滴鼻免疫后SPF鸡气管结构完整,无明显损伤;滴鼻免疫后试验组SPF鸡气管酸性黏液分布容积在免疫后的第0和2天显著高于对照组(P<0.05),而后明显降低,于免疫后的第6天又有所升高,但差异不显著(P>0.05);硫酸化黏液分布容积在免疫后的第0和2天显著升高(P<0.05),而后降低并与对照组相一致。结果表明,新城疫疫苗滴鼻免疫后前两天SPF鸡气管黏液分泌增多,而后恢复到正常水平,疫苗的免疫对气管形态结构和纤毛的摆动速率无明显影响。