益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响

背景:益气解毒中药复方在体外能通过下调端粒酶的活性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡,还可能通过抑制细胞内重要的核转录因子、细胞分裂增殖、细胞周期、DNA修复和诱导细胞凋亡、促进坏死等信号通路,从而抑制细胞增殖和诱导细胞死亡。目的:实验拟观察益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及凋亡相关基因bax、bcl-2、增殖细胞核抗原和p53mt基因表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/2007-12在湖南中医药大学中西医结合学院基础研究室和中医五官重点学科实验室完成。材料:G4代8月龄TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因阳性小鼠和阴性小鼠各24只,体质量(25.4±2.3)kg,用于制备鼻咽和鼻腔癌前病变模型;益气解毒颗粒方药液为自制。方法:48只小鼠随机分为4组,转基因阳性中药组和转基因阴性中药组小鼠灌胃益气解毒颗粒方药液,给药剂量为12.91g/(kg·d);转基因阳性生理盐水组和转基因阴性生理盐水组小鼠灌等体积生理盐水。主要观察指标:苏木精-伊红染色观察鼻腔和鼻咽黏膜病理组织学变化,免疫组织化学染色法检测其bax、bcl-2、增殖细胞核抗原和p53mt基因表达水平。结果:纳入转基因阳性小鼠和阴性小鼠各24只,转基因阳性生理盐水组和转基因阴性生理盐水组于实验结束前各死亡1只,转基因阴性中药组死亡1只,转基因阳性中药组死亡2只小鼠,共43只小鼠进入结果分析。①转基因阴性生理盐水组、转基因阴性中药组小鼠的鼻腔/鼻咽黏膜组织均无明显病变;转基因阳性中药组有1只小鼠表现中度非典型性增生,转基因阳性生理盐水组有10只小鼠鼻腔和/或鼻咽黏膜上皮细胞呈现中度或中度以上非典型增生或灶性鳞状化生。转基因阴性生理盐水组、转基因阴性中药组、转基因阳性中药组和转基因阳性生理盐水组小鼠鼻腔或鼻咽黏膜上皮癌前病变率分别为0、0、10%和90.9%,差异具有显著性意义(P<0.01)。②与转基因阳性生理盐水组相比,其他各组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞中p53mt、bcl-2和增殖细胞核抗原表达水平均下降(P<0.01),bax表达水平显著增高,bcl-2/bax比值降低(P<0.01)。结论:益气解毒方中药可有效抑制或逆转TgN(p53mt-LMP1)/HT阳性小鼠鼻腔或鼻咽黏膜上皮的癌前病变表型,其作用机制之一可能通过下调p53mt基因和增殖细胞核抗原的表达,降低bcl-2/bax比值,使细胞增殖和凋亡速度达到平衡,进而促使鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞正常增长。

重组质粒pLMP1-p53mt在人鼻咽癌HNE1和人宫颈癌HeLa细胞中的表达分析

目的:研究重组质粒pLMP1-p53mt中EB病毒LMP1基因和突变型p53(p53mt)基因在HNE1和HeLa细胞中的体外表达。方法:体外培养人鼻咽癌细胞株HNE1和人宫颈癌细胞株HeLa,采用脂质体lipofectAMINETM2000介导将重组质粒pLMP1-p53mtDNA转染细胞,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Sourthernblot法分析p53mt基因和LMP1基因的表达情况。结果:经重组质粒pLMP1-p53mt转染的HNE1和HeLa细胞中检测到了p53mt基因和LMP1基因的表达。结论:重组质粒pLMP1-p53mt的LMP1基因和p53mt基因能分别在EDL-2启动子和CMV启动子控制下表达。该质粒可进一步用于转基因动物的制备和基因功能研究。

TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖与p16 c-jun基因表达的关系

目的:研究TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖与p16、c-jun基因表达的关系。方法:TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠和野生型C57BL/6J小鼠分别分为诱癌组和对照组,即TgN(p53mt-LMP1)/HT摘要目的:研究TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖与p16、c-jun基因表达的关诱癌组(TI)、TgN(p53mt-LMP1)/HT对照组(TC)、C57BL/6J诱癌组(CI)和C57BL/6J对照组(CC)4组,H-E染色法观察各组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖特征,比较癌前病变率;免疫组织化学染色法检测各组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮组织中p16、c-jun基因的表达水平。结果:TI组小鼠鼻腔或鼻咽黏膜上皮细胞非典型性增生明显,TI、TC、CI和CC组小鼠鼻腔和/或鼻咽黏膜上皮癌前病变率分别为90%、10%、0和0。与TC、CI和CC组相比,TI组鼻腔和鼻咽上皮细胞p16基因表达水平显著降低(P<0.01)和c-jun基因表达水平显著增高(P<0.01);与CC组相比,TC组两基因的表达也具有同样的变化趋势(P<0.01)。结论:TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖活性增加,二亚硝基哌嗪可提高TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞的增殖活性,而细胞增殖活性增加与p16基因表达水平下调和c-jun基因表达水平上调密切相关。

二亚硝基哌嗪对转基因小鼠TNF受体相关因子2和p16的表达

目的研究二亚硝基哌嗪(N,N′-dinitrosopi- perazine,DNP)对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖与TNF受体相关因子2(TNF receptor-associated Factor 2,TRAF2)、p16基因表达的影响及两者关系。方法HE染色法观察转基因小鼠组(TC)、转基因小鼠DNP诱导组(T1)和野生小鼠组(CC)、野生小鼠DNP诱导组(CI)鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖特征;免疫组织化学染色法检测小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮组织中TRAF2、p16基因的表达水平。结果TI、TC、CI和CC组小鼠鼻腔或鼻咽黏膜上皮癌前病变率分别为90%、10%、0和0。与TC、CI和CC组相比,TI组TRAF2基因表达水平显著增高(P<0.01),而p16基因表达水平显著降低(P<0.01);TRAF2和p16基因表达水平在TC和CC组之间的差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖活性增加,DNP可提高其增殖活性,而细胞增殖活性增加与TRAF2基因表达水平上调和p16基因表达水平下调密切相关。

转基因雄性小鼠不育原因分析

目的研究转基因雄性小鼠不育的主要原因。方法以野生型C57BL/6J作为对照,比较检测健康性成熟雄性转基因小鼠的睾丸、附睾、前列腺、提肛肌的脏器系数和精子数、精子活动度、活精率、精子畸形率;观察睾丸组织病理学变化及睾丸组织葡萄-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸脱氢酶同工酶(LDH-X)及琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性。结果与正常非转基因对照鼠相比,转基因鼠睾丸的脏器系数与正常对照鼠相接近,附睾、提肛肌的脏器系数显著降低,精子数、直线运动精子数显著降低(P<0.01);转基因鼠睾丸组织曲细精管变薄,生精细胞排列不整齐,层次减少(2层),上皮部分有变性,精原细胞、初级精母细胞分裂异常,精子形成减少;G-6-PD、LDH、LDH-X及SDH的活性均显著低于对照鼠。结论外源基因整合后,引起睾丸组织酶活性下降,影响各细胞的生理、生化功能,进而引起睾丸发育严重障碍,精子减少和活动能力降低而导致不育。

益气解毒方对转基因小鼠上皮细胞及基因影响

目的研究益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠的鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖及肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)和p16基因表达的影响。方法苏木素-伊红(H-E)染色法观察小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞增殖特征;免疫组织化学染色法检测小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞TRAF2、p16基因的表达水平,并采用蛋白印迹(Westernblot)对基因表达进行验证。结果与TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠诱癌生理盐水对照组(TIC组)比较,TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠诱癌益气解毒方干预组(TIM组鼻腔和鼻咽粘膜上皮增生不明显,癌前病变率显著下降(P<0.01);其TRAF2基因表达水平(TIC组、TIM组鼻腔的分别为129.45±9.53和160.96±11.04,鼻咽的分别为126.38±12.69和160.88±6.84)显著降低(P<0.01);p16基因表达水平(TIC组、TIM组鼻腔的分别为157.21±10.44和131.72±10.06,鼻咽的分别为155.41±11.77和132.63±10.22)显著增高(P<0.01)。TIM组的TRAF2和p16基因表达水平接近野生型C57BL/6J小鼠对照组(鼻腔和鼻咽的TRAF2基因表达水平分别为165.07±10.58和164.39±7.88,p16基因表达水平分别为129.62±12.16和129.12±11.67),差异无统计学意义。结论中药益气解毒方可阻逆二亚硝基哌嗪(DNP)对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽粘膜上皮细胞异常增殖的诱导效应,其阻逆作用的发挥与下调TRAF2基因表达和上调p16基因表达密切相关。