鸡毒支原体的分离鉴定

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）会引发鸡的慢性呼吸道疾病（chronic respiratory disease，CRD）。本研究从吉林经济技术开发区鸡场采集的疑似支原体感染病料中分离、培养获得一菌株，经菌落形态观察、菌落红细胞吸附试验、生化特性测定及血清学鉴定等试验，证明该分离株为鸡毒支原体（MG），并命名为JL株。

鸡可食性组织中尼卡巴嗪残留的测定高效液相色谱法

为建立鸡可食性组织(皮脂、肌肉、肝脏、肾脏)中尼卡巴嗪的高效液相色谱(HPLC)检测方法,本研究采用乙腈提取组织样品中尼卡巴嗪,正己烷除脂;流动相为乙腈:超纯水(55:45,v/v);紫外检测波长347 nm.结果显示:各组织中尼卡巴嗪浓度在50~1000μg/kg范围内呈良好线性关系(R^2≥0.9992);各组织中检测限和定量限均分别为10μg/kg和50μg/kg;组织中尼卡巴嗪添加浓度为50、200、400μg/kg时,皮脂中药物平均回收率为(87.18±3.85)%,肌肉中药物平均回收率为(93.33±3.76)%,肝脏中药物平均回收率为(80.77±3.63)%,肾脏中药物平均回收率为(85.27±6.58)%;日内和日间变异系数分别小于4.20%和4.30%.该方法前处理简单省时,无需使用固相萃取,节约了试验成本与时间,为尼卡巴嗪的检测提供了方法学基础.

猪β2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β_2肾上腺素能受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β_2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β_2AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N、myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-C285S和mycpcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β_2AR基因已正确重组入pcDNA3.1(+)载体中;经测序鉴定,猪β_2AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β_2AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β_2AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。

鸡黑素皮质素受体3真核表达载体及突变型的构建和表达

试验旨在构建鸡黑素皮质素受体3(c MC3R)基因的真核表达载体,并在人源胚胎肾细胞(HEK293T)观察目的基因的表达情况。从新鲜鸡血液提取全基因组DNA,并以其为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。凝胶纯化回收目的基因,用限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ目的基因和真核表达载体pc DNA3.1(+),并将双酶切后的目的基因定向插入表达载体中。经酶切和测序正确后加入c-myc标签。单点突变构建pc DNA3.1(+)-myc/MC3R突变型,用脂质体法将重组质粒pc DNA3.1(+)-myc/MC3R分别瞬时转染入HEK293T细胞中,流式细胞仪检测野生型和突变型的细胞表面表达和胞内总表达。结果表明,成功构建了鸡MC3R基因野生型和四个突变型(M54L、G104S、L151R和S183S)的真核表达载体,突变型与野生型在HEK293T细胞中的表面表达和胞内总表达没有显著性差异,研究结果为进一步研究c MC3R功能奠定基础。