细胞自噬对饥饿环境下椎间盘髓核细胞的保护作用

目的:探讨饥饿条件下椎间盘髓核细胞是否发生自噬及自噬对髓核细胞的作用。方法:原代培养SD大鼠髓核细胞,对细胞表型进行鉴定后,将细胞分为正常对照组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)加DMEM培养基组、3-MA加EBSS培养基组和EBSS饥饿组,接着用单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色、透射电镜和Western blotting观察各组细胞的自噬差异,最后采用CCK-8法测定细胞生长抑制率以及TUNEL法测定细胞凋亡率。结果:成功培养出SD大鼠髓核细胞。与对照组相比,电镜和荧光显微镜下观察到EBSS培养基诱导的髓核细胞出现自噬囊泡,但是3-MA抑制后细胞自噬泡明显减少;Western blotting检测发现LC3-II/LC3-I和Beclin-1/β-actin在EBSS处理组明显大于3-MA+EBSS处理组和对照组(P<0.05),而3-MA+EBSS处理组的细胞抑制率和凋亡率明显高于EBSS处理组(P<0.05)。结论:饥饿可以诱导大鼠椎间盘髓核细胞发生自噬,并且3-MA能抑制自噬发生。自噬对饥饿环境下的髓核细胞可能具有一定的保护作用。

成纤维细胞生长因子2在椎间盘中表达与作用的研究进展

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor．FGF）目前发现总共有22种．但在椎间盘领域主要涉及的是成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2．FGF2）^[1]。因为FGF2呈碱性，故亦称为碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。

细胞自噬在糖尿病大鼠椎间盘退变中的作用

目的:探讨凋亡和自噬水平在糖尿病大鼠椎间盘髓核组织中的变化及其作用。方法:SD大鼠注射链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病模型16周后,完整获取大鼠腰椎间盘,经石蜡包埋切片、苏木素-伊红(HE)染色和阿里新蓝染色,在组织水平检测椎间盘病理变化。DNA原位末端标记法(TUNEL)检测髓核细胞凋亡率,免疫组织化学及Western blotting方法检测髓核组织凋亡和自噬水平。结果:HE和阿里新蓝染色显示糖尿病大鼠椎间盘发生退变。和正常组相比,caspase-3阳性细胞比例在糖尿病大鼠椎间盘中明显增加。TUNEL结果显示糖尿病大鼠椎间盘髓核细胞凋亡率升高。Western blotting和免疫组织化学检测发现自噬指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和beclin-1表达量在糖尿病大鼠组均高于正常组。结论:STZ诱导的糖尿病可加速大鼠椎间盘退变,并且提高了髓核组织中凋亡和自噬水平。

稳定过表达生长分化因子5基因大鼠脂肪干细胞系的建立

目的:探讨慢病毒介导的稳定过表达生长分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干细胞(ASCs)的构建条件和方法。方法:取大鼠腹股沟脂肪垫组织,采用Ⅰ型胶原酶消化贴壁法分离培养大鼠ASCs。倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法测定细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定细胞表型。制备带GDF-5/GFP融合基因的慢病毒载体系统,探索不同感染复数(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的转染效率,选择最佳MOI,采用流式细胞仪检测转染效率。对转染细胞行流式细胞筛选,测定筛选后转染细胞的阳性率。筛选出的细胞行细胞爬片,DAPI染色,形态学上进一步验证细胞阳性率;并采用CCK-8法检测转染后细胞活力。结果:成功培养大鼠ASCs,流式细胞免疫表型鉴定:间充质干细胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表达阳性,造血细胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干细胞表面抗原(CD106)表达阴性。成功构建GDF-5过表达慢病毒载体系统,慢病毒转染大鼠ASCs最佳MOI为40,转染率为65%。采用GFP荧光流式细胞筛选技术筛选后阳性率可提高至96%。CCK-8法显示,转染后细胞活力、生长曲线与未转染细胞无明显差异。结论:胶原酶消化法可成功培养大鼠ASCs,流式细胞筛选技术可显著提高转染细胞阳性率,且对细胞系活力无显著影响。

常温下高锰酸钾酸性溶液能氧化甲苯(二甲苯)吗?

用高锰酸钾酸性稀溶液来区别苯与甲苯、二甲苯的实验,在高中或高师教材中沿用了几十年,八十年代也曾出现在高考试卷中。然而,在我们几十年的教学实践中。

酸环境对大鼠髓核细胞自噬及功能的影响

目的:观察酸环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)中卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1,OGR1)和自噬相关蛋白LC3的表达水平,探讨自噬激活机制,初步分析其对细胞功能的影响.方法:取SD大鼠正常髓核组织,分离培养NPCs,甲苯胺蓝、阿利新染色和Ⅱ型胶原免疫荧光检测鉴定NPCs.扩增培养NPCs,取第2代NPCs,在pH值为6.2、6.4、6.8、7.0、7.2和7.4的培养基中培养24h,免疫荧光观察NPCs中OGR1的表达情况,Western blotting检查细胞中OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平;在pH值为6.4的培养基中培养0、3h、6h、12h、24h、48h后,采用Western blotting检测NPCs中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达水平.构建3个不同靶点的OGR1干扰序列,检测最合适滴度慢病毒,用最适滴度慢病毒转染NPCs,使用Western blotting和Real-time PCR检测不同干扰序列的沉默效果,选取最适干扰系列构建OGR1-shRNA慢病毒载体.取第2代NPCs,分为4组:正常组(DMEM培养基)、pH值6.4培养基组(空白组)、pH值6.4培养基空载体组(空载体组)、pH值6.4培养基OGR 1-shRNA慢病毒转染组(转染组),培养24h后用Western blot-ting检测LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平;Alcian染色观察NPCs中蛋白多糖的表达情况.结果:(1)分离培养的细胞高表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,符合NPCs表型.(2)OGR1蛋白表达水平与培养基pH值相关,pH值<7.0时,OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著性升高(P<0.05),pH值6.4时表达量最高.(3)在pH值6.4的培养基中培养时,细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达量与培养时间有关,24h时达高峰,48h仍较高.(4)3个干扰序列对OGR1均有沉默作用,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),OGR 1-shRNA1沉默效果最佳.(5)转染组细胞在pH值6.4的培养基中培养24h后,LC3-Ⅱ表达水平显著性低于空载体组(P<0.05);p62表达水平显著性高于空载体组(P<0.05);蛋白多糖的表达低于空载体组(P<0.05).结论:酸环境可促进大鼠NPCs中OGR1蛋白表达和自噬水平升高,OGR1介导了细胞自噬的激活,并影响NPCs的生物学功能.

51dir初探Rails

虽然写程序不是我的职业，但这些年来断断续续地一直在写，也许是好奇心使然，尝试了许多不同的编程语言和运行环境。最早接触的是微软的ASP，我用它编写了一个被称作女网的化妆品销售网站，当时是1999年底，那还是8848网站很火的年代。我的女网运行了大半年之后，很快被淹没在不计其数的B2C网站中。

不同细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌至胞外的膜性囊泡样微体。外泌体在以骨关节炎(osteoarthritis,OA)和椎间盘退变为主的骨科退行性疾病的诊疗中具有应用价值。包括间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在内的多种细胞来源的外泌体具有抑制软骨细胞退化、促进再生等作用。其中研究最为广泛的是MSC来源外泌体,其优点在于细胞来源丰富、产量较高、易获得。而软骨细胞外泌体内的微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱与其亲本细胞存在显著差异,提示其在软骨分化和维持内稳态也具有重要作用。正常髓核细胞来源外泌体可促进MSC迁移及向髓核细胞定向分化,炎症下的滑膜细胞外泌体还可成为加重软骨退变的因素。本文通过对不同细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的研究进行综述,为该类疾病的诊断和治疗带来新的思路。

老年颈椎病患者颈前路次全切应用限制性与非限制性钛板的疗效对比

目的分析老年颈椎病患者的颈前路椎体次全切除钛网植骨融合内固定术中采用限制性和非限制性钛板的临床疗效和影像学变化。方法将58例行颈前路椎体次全切除钛网植骨融合内固定术的老年颈椎病患者分为限制性钛板组（30例）和非限制性钛板组（28例），比较两组的临床疗效及影像学表现。结果非限制性组与限制性组相比，末次随访时的日本矫形外科协会（JOA）评分改善率分别为（77．7±18．6）％、（75．8±23．2）％（t=0．340，P=0．735）；术后3个月，两组的融合率分别为89．3％、63．3oA（x2=5．327，P=0．021）；术后3、6、12个月，非限制性组与限制性组相比，融合节段高度的丢失增大（2．42±3．05）mm和（0．98±2．86）mm、（3．95±3．65）mm和（2．34±2．97）mm、（3．60±4．33）mm和（2．40±2．96）mm，融合节段前凸角度的丢失增大（1．64±2．33）°和（O．66±2．14）°、（2．13±3．79）°和（0．70±2．99）°、（2．39±4．26）°和（0．86±3．25）°，但是差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论两种钛板的临床疗效差异无统计学意义，且非限制钛板有助于患者的椎间植骨的早期融合。但是非限制性钛板有可能加重老年患者的融合节段前凸角度和高度的丢失，因此老年骨质疏松患者应慎用。

硬膜外静脉曲张误诊为腰椎间盘突出症一例

患者女性，57岁，主因“腰痛伴右下肢放射痛5年，间歇性跛行2年”于2011年4月25日来我院就诊。患者经长期保守治疗，症状无明显改善。体检：腰椎活动受限．L4-5，棘突旁压痛，有下肢直腿抬高试验60°，双下肢肌力、感觉、

α半水硫酸钙复合功能化多壁碳纳米管骨修复材料生物相容性

旨在评价α半水硫酸钙复合功能化多壁碳纳米管骨修复材料的生物相容性,为后期临床实验奠定基础。分别采用兔L929成纤维细胞与材料浸提液以及材料片剂与兔骨髓基质干细胞复合培养,在不同时段运用倒置显微镜观察,MTT检测,扫描电子显微镜分析等手段,观察材料对细胞的相容性;进行急性、亚急性毒性实验,肌肉植入实验,骨植入实验等,观察材料对组织的相容性。结果表明,L929成纤维细胞在材料浸提液中生长良好,MTT检测与对照组无显著差异(P>0.05);扫描电子显微镜结果显示,细胞能在材料上黏附并增殖;体内实验表明材料对机体无毒,无致敏性,组织相容性佳。α半水硫酸钙/碳纳米管复合材料表现出的良好生物相容性,有望在骨组织工程中得到广泛运用。

脂肪干细胞与纤维环细胞共培养后的类纤维环分化效应研究

干细胞移植是治疗椎间盘退变的新方向,而对纤维环的修复是治疗椎间盘退变的前提。该研究利用Transwell共培养系统在常氧(20%)及低氧(2%)条件下探讨共培养诱导后SD大鼠脂肪干细胞向类纤维环细胞的分化能力。1,9-Dimethylmethylene blue(DMMB)检测表明,低氧组脂肪干细胞诱导7,14,21 d后及常氧组脂肪干细胞诱导14 d及21 d后与对照组脂肪干细胞相比分泌氨基聚糖明显增加(P<0.05),且共培养14 d及21 d后低氧组脂肪干细胞较常氧组脂肪干细胞分泌氨基聚糖含量明显增多(P<0.05)。qRT-PCR检测结果表明,与对照组相比,共培养14 d及21 d后常氧组及低氧组ADSCs COL I、COL II及Aggrecan mRNA表达均明显增强(P<0.05),且低氧组ADSCs表达量高于常氧组(P<0.05)。COL I、COL II免疫组化及阿利辛染色也证实了上述结果。由此说明共培养可以诱导脂肪干细胞向类纤维环细胞分化,且低氧(2%)有利于这种分化的发生。

Dynesys融合和非融合固定混搭手术治疗腰椎退行性疾病的中长期疗效

目的评估Dynesys混搭手术(部分节段采用Dynesys非融合固定,另部分节段采用Dynesys联合椎间融合器融合固定)治疗腰椎退行性疾病(lumbar degenerative disease,LDD)的中长期疗效。方法回顾性分析2011年5月至2016年9月期间27例LDD接受Dynesys融合固定和非融合固定混搭手术治疗且随访完整的病历资料(混搭组)。男8例,女19例;年龄(59.1±11.9)岁(范围23~78岁)。腰椎管狭窄症13例,腰椎间盘突出症14例;合并腰椎动力位不稳4例,腰椎滑脱7例。双节段病变15例,L3~L59例、L4~S16例;三节段病变11例,L3~S17例、L2~L54例;四节段病变1例,L2~S11例。均采用后路正中切口,双侧椎弓根螺钉植入,在融合节段加植入椎间融合器植骨融合。以同期27例接受经椎间孔腰椎椎间融合术(transforaminal lumbar interbody fusion,TLIF)的病例作为对照。临床指标包括腰痛和下肢痛的疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale,VAS)、Oswestry功能障碍指数(Oswestry disability index,ODI)。影像学指标包括融合率、固定节段和头侧邻近节段的椎间隙高度(disc hight,DH)、非融合节段和头侧邻近节段的椎间活动度(range of motion,ROM)。记录并发症发生情况。结果混搭组和融合组随访时间分别为(83.8±20.9)个月(范围48~112个月)和(87.3±16.2)个月(范围53~114个月)。两组患者基线资料(随访时间、年龄、性别、手术节段、疾病诊断)的差异均无统计学意义。混搭组手术时间为(183.0±27.8)min,术中出血量为(301.9±178.9)ml,明显少于融合组(t=2.337,P=0.023;t=2.706,P=0.01)。两组患者末次随访腰痛VAS评分(t=12.164,P<0.001)、下肢痛VAS评分(t=20.703,P<0.001)和ODI(t=22.827,P<0.001)均较术前有明显改善。混搭组共32个节段接受TLIF+Dynesys固定,35个节段接受Dynesys非融合固定,术后1年28个融合节段(87.5%)获得骨性融合。融合组共67个融合节段,术后1年融合率为85.1%。混搭组末次随访时非融合固定节段DH较术前有所降低(t=2.647,P=0.012),而混搭组融合节段和融合组手术节段末次随访时DH均较术前有所增加。末次随访时非融合固定节段保留了一定的ROM(2.4°±1.5°),非融合固定节段的头侧邻近节段ROM明显小于融合节段的头侧邻近节段(t=2.126,P=0.044)。混搭组中4例患者(8枚螺钉)发生影像学松动,5例患者发生影像学邻近节段退变(adjacent segment degeneration,ASD);融合组中3例患者(6枚螺钉)发生影像学松动,8例患者发生ASD,均未接受再手术治疗。两组患者随访期间均未发现螺钉断裂。结论Dynesys动态固定联合椎间融合的混搭手术治疗LDD安全、有效,融合率不亚于刚性固定融合手术。与多节段融合手术相比,该术式具有创伤小,保留部分手术节段活动度的优势。