黄曲霉基因敲除体系的构建及其RNA依赖的RNA聚合酶1基因在生长发育中的作用

目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1基因突变菌株;对RDRP1基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量。结果获得ptrA抗性转化子13个;Sourthern blot鉴定4个为RDRP1基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14相比,RDRP1基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P>0.05)。结论overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用。

AGO和RDRP基因参与黄曲霉压力应激反应

目的探究RNA干扰(RNAi)机制中Argonaute(Ago)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因在黄曲霉生长发育中的作用。方法利用同源重组的方法构建黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因突变菌株,接种10^(6)CFU/mL孢子悬液3μl至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基上观察突变菌株的生长发育现象。在小量酵母提取物葡萄糖(YGM)培养基中加入200、400μg细胞壁压力试剂刚果红(CR),0.8 mol/L、1.6 mol/L渗透压药物氯化钠(NaCl),氧化压力试剂2 mmol/L、4 mmol/L过氧化氢(H_(2)O_(2)),基因组损伤剂0.01%、0.02%甲磺酸甲酯(MMS)试剂分析突变菌株的压力应激反应。结果成功构建黄曲霉突变菌株ΔAgo1、ΔAgo2、ΔRDRP1、ΔRDRP3且生长发育正常。ΔAgo1、ΔAgo2菌株相比对照可降低对细胞壁和渗透压的胁迫影响。Ago1基因缺失可降低H_(2)O_(2)的影响,相反RDRP3基因缺失,H_(2)O_(2)的抑制作用增加。ΔAgo2、ΔRDRP1菌株能降低对基因损伤剂的作用。此外,ΔRDRP1增加渗透压胁迫作用。结论黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因不参与生长速率和无性繁殖调控,可以参与调节宿主菌对环境的应激反应。

贵阳市5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌种类及携带真菌病毒调查

目的:分析贵阳市5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌种类及携带真菌病毒的情况。方法:采用含50 mg/L头孢霉素的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板敞口置于病房24 h后收集平板培养,检测5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌株;采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取真菌病毒DNA、纤维素吸附的方法提取菌病毒双链RNA(dsRNA),琼脂糖凝胶电泳检测真菌病毒。结果:共收集到曲霉菌597株,其中黄曲霉菌株467株,烟曲霉菌株90株,黑曲霉菌株40株;CTAB法未检测到DNA病毒,纤维素吸附法检测到dsRNA病毒,90株烟曲霉菌株中有11株含有dsRNA病毒,病毒电泳条带类型有2种;467个黄曲霉菌株中有24株含有dsRNA病毒,病毒电泳的条带类型有3种;40个黑曲霉菌株有9株含有dsRNA病毒,病毒电泳条带类型只有1种。结论:烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌株中携带有较多dsRNA病毒。

PEG介导黄曲霉菌的遗传转化体系

目的:以吡啶硫胺抗性基因(ptrA)为筛选标记基因,建立黄曲菌遗传转化体系。方法:通过黄曲霉菌对潮霉素B(Hyg)、新霉素(G418)和嘧啶磺胺素(PT)的敏感性实验获得适合黄曲霉菌遗传转化筛选抗生素,用酶解的方法获得黄曲霉菌的原生质体;采用聚乙二醇(PEG)介导黄曲霉菌原生质体转化法,将携带ptrA的质粒pPTRI整合到黄曲菌株LD-F基因组DNA中,随机挑选7个转化子,通过聚合酶链反应(PCR)方法进行检测,验证ptrA是否整合到黄曲菌基因组DNA中。结果:0.2 mg/L PT可以完全抑制黄曲霉菌的菌丝生长,1%溶壁酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶处理黄曲霉菌丝2 h可得到大量的原生质体;PCR检测结果显示,质粒pPTRI能够成功整合到黄曲菌基因组。结论:以PT为抗性筛选,建立PEG介导黄曲霉菌的遗传转化体系。

基于RNA-Seq技术的真菌病毒AfPV1感染对寄主黄曲霉基因表达的影响

目的基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨真菌病毒黄曲霉(A.flavus)partitivirus 1(AfPV1)感染对寄主A.flavus基因表达的影响。方法分别提取无病毒感染的A.flavus菌株LD-F1和真菌病毒AfPV1感染的A.flavus菌株LD-F1-b的RNA进行文库构建和RNA-Seq;以A.flavus菌株NRRL 3357(GCA_009017415.1)的基因组为参考,分析RNA-Seq测序结果中有差异表达的基因(DEGs),并对DEGs进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析;随机选取12个DEGs,使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对转录组进行验证。结果样品RNA完整无污染,测序结果可靠,错误率0.02%,测序的结果能够成功比对到A.flavus的基因组序列(>56%);获得真菌病毒AfPV1感染的A.flavus的DEGs有4127个;GO富集分析显示,DEGs涉及A.flavus的氧化还原过程、单生物过程、单生物代谢过程、跨膜转运、谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成过程、二羟酸代谢过程及血红素结合等;KEGG富集分析显示,DEGs参与A.flavus代谢通路中的戊糖与葡萄糖醛酸互相转换、非同源重组末端连接、氮代谢、错配修复、同源重组、DNA复制、次级代谢产物的生物合成及碱基切除修复等;qRT-PCR的结果与转录组测序结果趋势一致。结论真菌病毒AfPV1感染A.flavus能够引起基因表达差异,DEGs涉及A.flavus生命过程中多个基因和多个信号通路。

真菌病毒AfPV1对寄主黄曲霉抗压力耐受的影响

目的探讨真菌病毒Af PV1感染后对寄主黄曲霉抗渗透压、氧化、细胞壁压力、紫外照射、巨噬细胞杀灭以及对细胞黏附的影响。方法将脱病毒菌株(LD-F1)及Af PV1感染菌株(LD-F1-b)黄曲霉孢子接种到含有细胞壁胁迫应激试剂、渗透压胁迫试剂和氧化试剂的YGM培养基、30℃黑暗培养5 d、检测病毒Af PV1对黄曲霉抗压力的影响;通过紫外线照射SDA培养基上的黄曲霉孢子,30℃黑暗培养48 h检测病毒Af PV1对黄曲霉抗紫外照射的影响;黄曲霉孢子与巨噬细胞(RAW264.7)和人肺上皮细胞(A549)共培养,比较黄曲霉孢子死亡率和黏附水平;通过黄曲霉孢子与巨噬细胞(RAW264.7)共培养后收集上清液检测白介素-10(IL-10)、IL-6、IL-1β、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)水平。结果真菌病毒Af PV1减弱了黄曲霉对渗透、氧化和紫外线的抵抗压力,但对细胞壁抗压能力无影响;真菌病毒Af PV1的感染能够降低黄曲霉对人肺上皮细胞A549的黏附能力,同时降低黄曲霉抵抗巨噬细胞杀灭能力;黄曲霉感染后,巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α,真菌病毒Af PV1感染黄曲霉会导致巨噬细胞有增加肿瘤坏死因子-α的产生趋势,但结果不显著。结论真菌病毒Af PV1感染能够降低寄主黄曲霉抗压能力。

重症监护病房医院感染耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药基因的研究与分析

目的:通过分析菌株耐药性和耐药基因检出情况,了解我院医院感染耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的流行病学特点,并探讨耐药机制,为临床合理选药提供参考。方法:筛选重症监护病房医院感染患者送检标本分离的CRAB,采用PCR扩增技术检测菌株是否携带OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、arm A、sul1和sul2基因。结果:53株医院感染CRAB对复方新诺明、妥布霉素较敏感,对其余13种抗菌药物耐药率均达50%以上,基因检出率依次为:TEM 100%,OXA-23 96.23%,arm A 90.57%,aac(6')-Ib22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60%,SHV 3.77%,VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未检出。共14组耐药基因检出与耐药情况完全相同的菌株。结论:我院医院感染CRAB的患者仍可考虑选用复方新诺明和妥布霉素进行治疗。我院定居并繁殖的CRAB耐β-内酰胺类抗菌药物的机制可能与TEM酶密切相关,携带OXA-23基因可能是耐碳青霉烯类抗菌药物的重要因素,检出率低的耐药基因可能在耐β-内酰胺类抗菌药物机制中的作用不大。我院不仅存在科室内部的交叉感染,而且存在科室之间的交叉感染,应加大力度做好感染控制工作。

50%贵锄WP防除小麦田杂草的效果

应用50%贵锄WP对麦田杂草看麦娘和牛繁缕进行了防治试验。结果表明,喷药后60 d对看麦娘的防效为93.96%～100%,对牛繁缕的防效为97.02%～100%,对照药剂10%苯磺隆WP防除看麦娘基本无效,50%扑草净WP对牛繁缕的防除效果较差。通过复配,扩大了杀草谱,提高了小麦安全性,防除效果和增产效果极其显著。

HPV基因芯片检测质控点设计和参数优化研究

目的:设计人乳头状瘤病毒(HPV)基因芯片的质量控制点,优化质量控制探针和人β珠蛋白基因引物浓度以及HPV引物浓度比例,以提高基因芯片的检测质量。方法:收集临床HPV患者宫颈刮片样本,提取样本HPV58的DNA,用HPV通用引物扩增病毒DNA;利用人β珠蛋白引物扩增样本中的β珠蛋白DNA,将扩增的PCR产物与线性化的p MD18-T载体连接,构建人β珠蛋白和HPV58 L1区DNA质粒,转化大肠杆菌后,进行单克隆培养,获得HPV58样本和人β珠蛋白的DNA模板;以HPV58和人β珠蛋白DNA基因信息设计并制备扩增HPV和人β珠蛋白探针及PCR引物,将人β珠蛋白基因探针固定于基因芯片作为质量控制点(QC),按1∶20、1∶10、1∶5和1∶4比例混合单克隆HPV扩增引物与人β珠蛋白扩增引物,采用PCR反向点杂交技术,对模板进行扩增后,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的产量,进行基因芯片孵育杂交和显色;用扫描仪扫描芯片,采用Image J软件对各阳性杂交信号点进行信号强度采集,计算最佳的人β珠蛋白扩增引物和HPV扩增引物浓度比值;将QC的探针点样浓度设为0. 1 pmol/L、1 pmol/L、10 pmol/L、50 pmol/L和100 pmol/L,检测信号强度,优化质量控制探针点样浓度。结果:扩增了HPV58病毒DNA和人β珠蛋白的DNA模板,设计了HPV58和人β珠蛋白探针及PCR引物;琼脂糖凝胶电泳检测分析发现,当人β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的浓度比例为1∶10时,二者同时PCR扩增时,扩增的强度较为一致,得到的产物量相当,用此引物浓度比例进行PCR获得的产物与测试芯片进行杂交,显色的平衡性较好;对QC的点样浓度进行测试发现,当QC点样探针浓度为50 pmol/L时,可以获得最佳的检测效果。结论:通过对β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的最佳浓度比例和质量控制探针最佳点样浓度的优化,提高了HPV检测点的检测质量。

不同曲霉感染大蜡螟幼虫模型的构建及曲霉毒力评价

目的探讨不同曲霉感染大蜡螟幼虫模型的构建及曲霉毒力的鉴定。方法取烟曲霉ygy和黄曲霉LD-F菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),30℃培养5 d,分别收集曲霉孢子并配制1×10^(8) CFU/L(低剂量)、1×10^(9) CFU/L(中剂量)及1×10^(10) CFU/L(高剂量)孢子悬液;取大蜡螟幼虫60条随机均分为6组,分别注射上述2种曲霉孢子悬液高、中、低剂量各10μL,同时再取大蜡螟60条幼虫随机均分为6组,对应2种曲霉各设置3种形式对照,即空白对照(UTC)组(不做任何处理)、穿刺(PC)组[微量注射器穿刺但不注射磷酸盐缓冲液(PBS)]及PBS组(注射接种PBS 10μL),各组大蜡螟幼虫于37℃黑暗环境培养5 d,每日监测各组大蜡螟幼虫的体表颜色、应对刺激反馈及存活情况,采用生存曲线评价2种曲霉的毒力强弱;取2种曲霉孢子悬液高剂量组大蜡螟幼虫感染48 h后死亡幼虫和同时点的UTC组大蜡螟幼虫,采用苏木精和曙红(HE)染色检测幼虫虫体组织的病理学特征,采用六铵银染色检测幼虫体腔内菌丝形成情况,二者结合判断幼虫感染曲霉是否成功。结果烟曲霉和黄曲霉感染幼虫后,幼虫黑化,其黑化程度与感染孢子悬液质量浓度无相关性,但其毒力有质量浓度依赖性(P<0.0001);组织病理检查可见幼虫体腔结构破坏,真菌菌丝在幼虫体内定植,表明曲霉感染模型构建成功。结论成功构建曲霉感染的大蜡螟幼虫模型,烟曲霉毒力高于黄曲霉,相同曲霉菌株毒力有质量浓度依赖性。

两种HPV基因芯片质控标准品质粒的构建

目的:构建人乳头状瘤病毒(HPV)HPV26和HPV73亚型的单克隆标准品质粒,用于HPV基因芯片制备的质量控制。方法:收集HPV26和HPV73两种亚型感染的临床宫颈刮片脱落细胞样品,提取并PCR扩增样品中HPV的L1区DNA片段,琼脂糖凝胶电泳验证DNA分子量大小;利用基因克隆技术,将L1区DNA片段连接到线性化的p MD18-T质粒载体上,进行琼脂糖凝胶电泳验证质粒连接反应,将构建的HPV质粒转化进入大肠杆菌进行扩增,对质粒进行测序,验证插入DNA序列的正确性;PCR扩增HPV亚型单克隆质粒的L1区特异性DNA片段作为检测标准品,用该标准品与本课题组制备的HPV分型基因芯片进行杂交反应,显色和扫描成像,检测HPV26和HPV73位点的显色情况,从而评估基因芯片HPV26和HPV73探针的特异性和点样质量。结果:从感染HPV患者宫颈刮片脱落细胞成功提取HPV26和HPV73的DNA,并PCR扩增了L1区DNA,琼脂糖凝胶电泳显示扩增的DNA片段符合预期分子大小,将这些DNA片段连接到p MD18-T载体上,电泳结果显示连接后的质粒大小符合预期值,基因测序证实插入的HPV26和HPV73的DNA片段序列正确;PCR扩增了HPV26和HPV73单克隆质粒的L1区特异性DNA片段,电泳显示分子量大小符合预期值;杂交反应显示HPV26和HPV73探针特异性和重现性好,探针的灵敏度为100%,特异性为100%。结论:制备了的HPV26和HPV73的单克隆靶标DNA标准品,可用于HPV基因芯片的质控。

耐碳青霉烯鲍氏不动杆菌耐药性与耐药基因检出关系探讨

目的以医院患者感染标本分离的耐碳青霉烯鲍氏不动杆菌(CR-AB)为对象,检测β-内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、16SrRNA甲基化酶和磺胺耐药酶共15个耐药基因,探讨耐药性与携带耐药基因的相关关系。方法采用PCR扩增技术对2014年1月-2015年5月收集的119株CR-AB菌株进行检测,检测是否携带OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ib、aph(3′)-Ⅰ、armA、sul1、sul2基因。结果 119株CR-AB对15种抗菌药物耐药率均>50.0%,基因检出率:TEM 100.0%、OXA-23 95.8%、armA 92.4%、aac(6′)-Ib 19.3%、aac(3)-I 24.37%、aph(3′)-Ⅰ73.11%、sul1 27.73%、sul2 60.50%、SHV2.52%,VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未检出。结论本地CR-AB耐β-内酰胺类抗菌药物的机制可能与TEM酶密切相关,但其作用机制受舒巴坦抑制;SHV、VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER酶可能在本地CR-AB耐β-内酰胺类抗菌药物机制中的作用不大;armA、aph(3′)-Ⅰ可能是本地CR-AB耐氨基糖苷类抗菌药物的重要元件,耐药是多基因联合作用的结果。

利用免疫抑制小鼠模型检测真菌病毒对黄曲霉菌致病力影响

【目的】构建用于比较黄曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)菌株之间致病力差异的小鼠感染模型,并利用该模型评价真菌病毒AfPV1对宿主A.flavus致病力的影响。【方法】用不同浓度环磷酰胺腹腔注射Institute of Cancer Research(ICR)小鼠,根据白细胞的数量判断小鼠免疫抑制程度;通过滴鼻和尾静脉两种感染方法接种不同浓度的A.flavus孢子量,统计14 d以内小鼠的死亡率,确定A.flavus最佳的孢子接种量;通过小鼠组织的菌落负荷量以及肺部组织的病理观察,确定A.flavus感染是否成功;最后利用该小鼠模型评价真菌病毒AfPV1对寄主A.flavus致病力的影响。【结果】腹腔注射环磷酰胺的浓度为250 mg/kg时,能够达到免疫抑制水平;小鼠组织真菌负荷和病理组织切片观察显示A.flavus成功感染接种的ICR小鼠组织;在滴鼻接种模型中,A.flavus的孢子接种量为40μL(1×10^(6) CFU/mL)时比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;在尾静脉接种的模型中,A.flavus的孢子接种量在50μL(1×10^(6) CFU/mL)比较合适评价A.flavus菌株之间的差异;病毒AfPV1能够引起A.flavus的致病力下降,但是不影响A.flavus在小鼠肺部的定殖量。【结论】本研究构建的小鼠感染模型能够评价A.flavus菌株之间致病力的差异;真菌病毒AfPV1的感染降低了宿主A.flavus的致病力。

耐药鲍曼不动杆菌噬菌体Abgy202162的分离、鉴定及治疗效果评价

目的从地下污水中分离出一株鲍曼不动杆菌噬菌体并对其进行研究,为噬菌体治疗鲍曼不动杆菌感染提供理论基础。方法以鲍曼不动杆菌GY-6为宿主菌,采用双层琼脂平板法分离噬菌体,对其进行生物学特性检测、治疗效果评价及遗传信息分析。结果分离到鲍曼不动杆菌噬菌体Abgy202162。透射电镜(TEM)分析显示,Abgy202162的形态呈二十面体结构。生物学特性分析表明其最佳感染复数为1,潜伏期为5 min,暴发量大小约为每个细胞520 PFU。此外,Abgy202162在不同浓度的三氯甲烷以及不同pH水平和温度下保持稳定。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,其含有10种蛋白质,分子量为15~100 ku。Abgy202162的双链DNA基因组由40889 bp组成,G+C含量为38.85%,包含47个开放阅读框(ORFs),其中26个ORFs具有特异性功能,未发现毒力相关基因或抗生素耐药基因。系统发育分析显示,Abgy202162是自转录噬菌体科,拜耶林克噬菌体亚科,弗留纳病毒属的一个新的噬菌体。Abgy202162在大蜡螟幼虫体内模型中表现出了治疗鲍曼不动杆菌感染的能力。结论噬菌体Abgy202162对环境耐受性强、安全性高,提示其有望成为抗生素的代替治疗剂用于治疗鲍曼不动杆菌引起的感染。