TNF-α对人肝细胞Mfn2基因表达的调节及对线粒体形态功能的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肝细胞株LO2细胞线粒体融合蛋白基因2(Mfn2)基因表达的调节作用以及对线粒体形态和细胞三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)生成的影响.方法:利用脂质体Lipofectamine2000将Mfn2基因荧光表达载体(pEGFP-Mfn2)转染肝细胞株LO2细胞,以终浓度为500kU/L的TNF-α作用LO2细胞株和稳定高表达Mfn2的LO2细胞株12h,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测各组细胞Mfn2mRNA转录水平以及蛋白的表达水平,线粒体绿色荧光探针(Mito-Tracker Green)染色观察线粒体形态变化,荧光素酶ADP/ATP发光法检测各组细胞ATP含量,荧光探针DCFH-DA测定细胞ROS生成水平.结果:经TNF-α处理后LO2细胞中Mfn2基因的mRNA及蛋白表达水平显著低于空白对照组(0.279±0.026vs0.742±0.018;0.196±0.024vs0.580±0.011,P<0.05);对照组及转染Mfn2基因组肝细胞线粒体形态主要为丝状网络或长柱状,TNF-α处理后未转染肝细胞线粒体断裂成点状碎片,但转染组线粒体形态则无明显改变;TNF-α处理后LO2细胞内ATP浓度显著下降(2.00μmol/g±0.15μmol/g vs5.81μmol/g±0.31μmol/g,P<0.05),而ROS生成水平较空白对照组显著升高(FI:80.68±4.02vs65.44±3.47,P<0.05),但转染组细胞内ATP下降水平要显著低于未转染组,而未转染组ROS升高程度则显著高于转染组(P<0.05).结论:TNF-α通过抑制肝细胞Mfn2的表达诱导线粒体形态改变及线粒体功能障碍.

Cdc42基因在表皮生长因子促进HepG2细胞丝状伪足形成中的作用

目的:探讨表皮生长因子(EGF)对HepG2细胞丝状伪足形成和细胞体外侵袭能力的影响以及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在其中的作用.方法:将Cdc42siRNA转染HepG2细胞株,RT-PCR和Westernblot检测EGF组、EGF+siRNA干扰组、siRNA干扰组及空白对照组细胞Cdc42mRNA转录以及蛋白的表达水平,微丝绿色荧光探针(actin-trackergreen)染色检测HepG2细胞丝状伪足形成,侵袭小室检测细胞体外侵袭能力.结果:经EGF处理后HepG2细胞可见明显丝状伪足形成,EGF组细胞内Cdc42mRNA及总蛋白(Total-Cdc42)表达量无显著变化,但活性Cdc42(Active-Cdc42)显著增高(0.713±0.021vs0.423±0.015,P<0.05),siRNA干扰组Cdc42表达及活性受到明显抑制(0.118±0.017vs1.128±0.024;0.351±0.021vs0.936±0.024,均P<0.05),并抑制EGF诱导的细胞丝状伪足形成,EGF组细胞体外侵袭能力显著高于其余各组(98.43±3.11vs61.09±3.58,50.53±2.34,62.73±2.64,均P<0.05).结论:EGF通过激活Cdc42诱导HepG2细胞丝状伪足形成并增强其体外侵袭能力.

Cdc42基因在非甾体抗炎药抑制乳腺癌细胞丝状伪足形成中的作用

目的:研究细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)基因在非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)诱导抑制细胞丝状伪足形成中的作用,探究NSAIDs抑制在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中可能的信号转导途径。方法:使用环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,Cox-2)选择性抑制剂NS-398处理乳腺癌MCF-7细胞,同时将针对Cox-2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染入MCF-7细胞;利用实时荧光定量-PCR和Western印迹法检测NS-398处理组、Cox-2 siRNA干扰组、干扰阴性对照组和空白对照组细胞中Cox-2和Cdc42的mRNA转录水平以及蛋白表达水平;使用微丝绿色荧光探针观察MCF-7细胞的伪足形态;Transwell小室检测MCF-7细胞的体外侵袭能力。结果:乳腺癌MCF-7细胞经NS-398处理后,细胞丝状伪足消失,体外侵袭能力显著下降(P<0.05);Cox-2mRNA转录及蛋白表达水平均未见明显改变(P>0.05),Cdc42 mRNA及总蛋白表达水平也未见明显改变(P>0.05),但活化态Cdc42含量显著减少(P<0.05)。经siRNA干扰Cox-2表达后,MCF-7细胞的丝状伪足消失,体外侵袭能力显著下降(P<0.05),活化态Cdc42含量显著减少(P<0.05)。结论:NSAIDs在体外抑制肿瘤细胞侵袭的作用可能是通过抑制Cox-2活性,使活化态Cdc42含量减少,最终抑制细胞丝状伪足形成而实现的。

细胞分裂周期蛋白42高表达在雌激素诱导的乳腺癌细胞耐药性增强过程中的作用

目的观察细胞分裂周期蛋白42（Cdcd2）在雌激素作用下的变化，探讨细胞内物质运输的改变在雌激素引发的乳腺癌细胞耐药中的意义。方法分别以100ng／ml 17β雌二醇（E2）处理MCF-7细胞，以Cdc,42的小干扰RNA（siRNA）Stealth Select RNAi^TM siRNA转染MCF-7细胞。采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的药物敏感性，流式细胞术检测细胞内阿霉素（ADM）的蓄积量，实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞的Cdc42 mRNA表达，Western blot法检测细胞活化的Cdc42蛋白及总Cdc42蛋白表达量。结果E2处理后，ADM对MCF-7细胞的半数抑制浓度（IC50）由（0．098±0．011）μg/ml增高到（0．134±0．130）μg/ml（P〈0．05），细胞内ADM的相对含量则由7．253±0．310下降为3．233±0．313（P〈0．05），而Cdc42 mRNA、活化Cdc42蛋白及总Cdc42蛋白的表达量均显著增加。（P〈0．05）。Cdc42 siRNA转染后，ADM对MCF-7细胞的IC50下降到（0．057±0．017）μg/ml（P〈0．05），细胞内ADM的相对含量增高为11．217±0．521（P〈0．05），而Cdcd2 mRNA、活化Cdcd2蛋白及总Cdc42蛋白则均有显著下降（P〈0．05）。结论雌激素可以诱导乳腺癌细胞耐药性增强，其机制可能是通过上调Cdc42基因的转录、表达和活化，加速胞内物质运输速度，使得化疗药物无法在细胞内聚集。

Cdc42在人乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株中的表达

目的探讨细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在乳腺癌细胞MCF-7阿霉素敏感株和耐药株MCF-7/Adr中表达的变化以及对细胞耐药性的影响。方法将Cdc42 siRNA转染MCF-7/Adr细胞株后,用RT-PCR和Weastern Blot方法检测MCF-7组,MCF-7/Adr组,MCF-7/Adr siRNA干扰组细胞Cdc42的转录以及蛋白的表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定siRNA处理后阿霉素(ADM)对MCF-7/Adr细胞的杀伤作用;用荧光分光光度计测定细胞内ADM药物浓度。结果 MCF-7/Adr细胞中Cdc42 mRNA及蛋白表达量显著高于MCF-7细胞(P<0.05);siRNA干扰后Cdc42表达受到明显抑制(P<0.05),并显著提高细胞内ADM的浓度(P<0.05)。结论特异性siRNA能明显抑制Cdc42 mR-NA及蛋白表达,并逆转细胞耐药性。