体外转录 mRNA 药物及其在肿瘤免疫治疗中的应用

体外转录(IVT)mRNA是以DNA为模板,转录指导合成相应蛋白质,可以在体内细胞中传递遗传信息。应用特定的IVT mRNA可通过宿主细胞的翻译机制表达产生免疫原蛋白或治疗性蛋白,促使机体产生免疫反应或对机体产生治疗效应,因此在临床上能够干预疾病进程。近年来,随着mRNA工程技术的发展,IVT mRNA作为一种具有较好应用前景的潜在药物,逐渐成为研究热点。其中在肿瘤免疫治疗领域中,IVT mRNA药物可以作为癌症疫苗,快速表达癌症抗原,产生抗体后杀死体内癌细胞,从而达到预防和治疗肿瘤的目的,该类研究已经取得了较大进展。本文系统介绍mRNA药物结构特点、独特优势及其在肿瘤免疫治疗中的临床应用。

免疫炎症反应在动脉粥样硬化中作用的研究进展

免疫应答在动脉粥样硬化(As)的发生、发展过程中起着至关重要的作用。Toll样受体(TLR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)作为介导机体免疫应答的重要炎性介质在As进程中起着重要作用。对免疫应答及相关炎症因子在As形成中的作用进行深入研究,不仅有助于理解As的形成过程,而且能为临床防治心血管疾病提供新的治疗靶点。

hMTH1缺陷细胞株建立及生物学特性研究

目的 建立hMTH1缺陷细胞株 ,观察该缺陷所引起的生物学效应。方法 用hMTH1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体 (pEGFP C1 T)转染人胚肺成纤维细胞 (HLF) ,半定量RT PCR鉴定其对hMTH1基因mRNA表达的抑制效果。同时观察转染细胞生长形态 ,绘制生长曲线 ,用流式细胞术观察细胞周期 ,软琼脂培养法鉴定恶性程度。结果 pEGFP C1 T载体在转染细胞内可较稳定表达 ,缺陷细胞株hMTH1mRNA表达水平比HLF细胞下降了 47%。hMTH1缺陷细胞生长形态无明显变化 ,细胞倍增时间为 0 89d ,与HLF细胞 0 93d接近 ,细胞周期各时相未受影响 ,软琼脂培养未见细胞集落。结论 hMTH1缺陷细胞株成功建立 ,该缺陷不足以单独引起可观察的生物学效应。

中国广东汉族人群核苷酸修复基因hMTH1遗传多态性研究

为研究中国南方汉族人群核苷酸修复基因hMTH1遗传多态性,应用聚合酶链反应 单链构象多态性技术检测172名健康人外周血白细胞hMTH1基因启动子及全部5个外显子多态性,并进行DNA测序。结果发现hMTH1基因启动子及外显子1序列保守,未见突变;外显子2第73位碱基存在T→C杂合型突变,基因型TT和TC频率分别为93 02%、6 98%,等位基因T和C频率分别为96 51%、3 49%;外显子3第45位遗传密码存在T→C杂合型突变,基因型TT和TC频率分别为95 35%、4 65%,等位基因T和C频率分别为97 67%、2 33%,该多态性为首次发现;外显子4第83位遗传密码存在G→A杂合型突变,基因型GG和GA频率分别为89 53%、10 47%,等位基因G和A频率分别为94 77%、5 23%;外显子5第119位氨基酸遗传密码存在C→T杂合型突变,基因型CC和CT频率分别为95 93%、4 07%,等位基因C和T频率分别为97 97%、2 03%。

聚合酶链反应-增强化学发光检测结核分枝杆菌

目的 探讨微孔板杂交技术结合增强化学发光 (ECL)检测结核分枝杆菌 (MTB)。方法 同时应用聚合酶链反应 (PCR) ECL、PCR 比色法与PCR电泳检测 6 0例活动性肺结核和 5 4例健康对照痰标本 ,比较结果。结果 PCR ECL、PCR 比色法与PCR电泳总阳性率分别为 76 .7%、6 3.3%、5 0 .0 % ,其中PCR ECL阳性率显著高于PCR电泳 (P <0 .0 5 ) ;对涂片阳性标本 ,阳性率分别为 85 .7%、85 .7%、71.4% ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;对涂片阴性标本 ,阳性率分别为 73.9%、5 6 .5 %、43.5 % ,PCR ECL阳性率高于PCR电泳 (P <0 .0 5 )。另外PCR ECL、PCR 比色法与PCR电泳特异性分别为 92 .6 %、96 .3%、96 .3% ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 PCR ECL灵敏度高 ,能提高临床标本MTB检出率 ,尤其是对涂片阴性痰标本 ,并且该方法操作简单 ,结果客观。

甲苯对作业工人体液免疫功能影响

目的探讨甲苯对作业工人体液免疫功能的影响。方法对某玩具厂进行劳动卫生学调查,分别采取接触甲苯的72名工人(暴露组)和不接触甲苯的55名包装厂工人(对照组)血清,测定血清中IgG、IgA、IgM、补体C3及C4含量。结果暴露组工人血清IgG、IgAI、gM含量分别为(12.41±4.63),(1.90±0.72)和(2.26±1.97)g/L,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);暴露组工人血清补体C3、C4含量分别为(1.25±0.90),(0.54±0.29)g/L,显著高于对照组(P<0.05)。结论接触甲苯对作业工作的体液免疫功能可产生一定影响。

胶质瘤的细胞来源研究进展

胶质瘤是原发性神经肿瘤中最常见和最具浸润性的一种,全球发病率约为每年7/10万。即使通过积极治疗,胶质瘤也极易复发,且预后较差,患者中位生存期通常只有15~19个月,5年存活率仅5%,全球每年约18~60万中青年人因罹患胶质瘤而死亡,给社会和家庭造成了巨大的精神痛苦和经济负担。根据细胞类型的不同,胶质瘤分为星形细胞瘤、室管膜瘤、少突胶质瘤、神经元-星形细胞瘤和髓母细胞瘤。尽管胶质瘤作为当今肿瘤研究的热点之一,基础和临床研究均有较大突破,但是胶质瘤的诱变外因、细胞来源及肿瘤发生发展的机制并未得到很好的阐明,影响了最佳治疗策略的制定。特别是细胞来源问题,作为导致胶质瘤异质性的关键因素之一。

mmLDL对小鼠肠系膜动脉α_1受体介导的血管收缩及相关蛋白表达影响的研究

目的探讨mm LDL对小鼠肠系膜动脉α1受体的作用。方法小鼠尾静脉注射mm LDL,微血管肌张力描记仪观察NA引起的小鼠肠系膜动脉收缩量效曲线变化,RTPCR、Western blot检测α1受体及α2受体表达。结果mm LDL引起NA收缩量效曲线明显增强,表现为Emax值由生理盐水(NS)组的(120.75±3.44)%上升为(161.00±6.87)%(P<0.01),p EC50值由NS组的(5.65±0.05)上升为(6.20±0.08)(P<0.01)。α1受体拮抗剂哌唑嗪引起量效曲线的明显右移,mm LDL引起α1受体m RNA水平、蛋白表达明显增加,对α2受体表达基本没有影响。结论尾静脉注射mm LDL上调小鼠肠系膜动脉α1受体。

胶质瘤干细胞微环境及其治疗靶点的研究进展

恶性胶质瘤是最常见和最具破坏性的原发性脑肿瘤,患者的中位总生存率仅15~19月。已有研究证实,胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)是存在于恶性胶质瘤中的一类具有较强自我更新、无限增殖能力和多向分化潜能的与神经干细胞类似的细胞群,并可能在肿瘤抗常规治疗和复发中起到关键性作用。由细胞间质及其中的体液成分构成的GSCs生存微环境,参与调控GSCs的增殖、分化、凋亡、耐药等机制,对维持干细胞的特性及肿瘤的破坏性意义重大。近年来相关微环境研究进展较大,使得胶质瘤的生长、浸润、迁移机制得到了更完善的解释,这也为恶性胶质瘤的治疗提供了新思路。本文将着重从GSCs的血管微环境、缺氧微环境、免疫微环境及其治疗靶点等方面进行综述。

二苯并呫吨类化合物CY-B12体外抗肿瘤细胞增殖的作用及其机制的初步研究

背景与目的:CY-B12是最近合成的新型二苯并呫吨类化合物,本研究探讨CY-B12的体外抗肿瘤细胞增殖作用及其机制。方法:MTT法测定CY-B12体外抑制胃癌细胞MGC803、鼻咽癌细胞CNE-2、口腔上皮癌细胞KB-3-1及肺癌细胞Glc82等细胞株增殖的作用,流式细胞仪检测CY-B12作用后细胞周期的改变及细胞凋亡,Hoechst33258染色后荧光显微镜观察细胞凋亡形态,Westernblot测定细胞周期相关蛋白Cdc25C、CyclinB1、Cdc2的改变,单细胞凝胶电泳检测CY-B12对细胞DNA的损伤作用。结果:CY-B12对MGC803、CNE-2、KB-3-1及GLC82等细胞株的增殖都有明显的抑制作用,IC50值分别为7.51、9.58、8.84和15.99μmol/L。CY-B12可诱导CNE-2细胞周期阻滞于G2/M期继而发生细胞凋亡,可观察到细胞染色质凝集、凋亡小体产生及凋亡峰出现。CY-B12作用24h后,细胞周期相关蛋白Cdc25C表达水平随CY-B12浓度升高而下调;CyclinB1蛋白在CY-B12浓度低时升高,CY-B12浓度高时表达下降;Cdc2蛋白变化趋势与CyclinB1相同。单细胞凝胶电泳证明CY-B12诱导了DNA损伤,并存在浓度-效应依赖关系。结论:CY-B12有较强的体外抗增殖作用,它可能通过断裂细胞DNA、下调周期相关蛋白Cdc25C、诱导细胞发生周期阻滞和凋亡而发挥其作用。

正己烷接触工人的早期生物标志物含量变化

目的探讨正己烷接触工人的早期生物标志物。方法分别检测正己烷接触工人63名及对照组50名工人的尿2,5-己二酮、血清神经元特异烯醇化酶(NSE)及髓鞘碱性蛋白(MBP)水平。结果接触组工人尿2,5-己二酮含量为0.31～10.38mg/gCr,对照组未检出;接触组血清NSE和MBP含量分别为(9.02±3.87)μg/L和(1.47±0.41)μg/L,均显著高于对照组(P<0.05)。结论正己烷接触可导致血清NSE及MBP水平的升高,尿2,5-己二酮、血清NSE和MBP水平可作为正己烷接触的早期生物标志物。

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的:通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。方法:根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,插入到pENTR/U6质粒缺口末端,连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体;通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest载体上,构建含U6启动子、靶序列和PolⅢ终止子表达框的MTCOX-IshRNA表达重组体;经脂质体导入293FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度。Westernblotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结果:将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒。Westernblotting检测结果证实构建的MTCOX-IshRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。结论:成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。

超微针刀结合三维平衡整脊治疗颈性眩晕的临床研究

目的比较超微针刀结合三维平衡整脊与常规针刺治疗颈性眩晕的疗效差异并探讨其机制。方法将60例颈性眩晕患者随机分为治疗组和对照组,各30例。治疗组先用超微针刀松解下项线及第1、2颈椎横突处的痛性结节,再用三维平衡整脊手法对颈椎进行整脊微调,间隔2 d治疗1次,3次为1个疗程;对照组用平补平泻手法针刺风池、风府、颈夹脊、百会、合谷,每日1次,10次为1疗程,1个疗程后观察疗效。结果两组方法均可改善颈性眩晕的症状,治疗组愈显率及总有效率分别为86.67%和96.67%,优于对照组的63.33%和80.00%(均P<0.01);两组治疗后患者症状与功能评分及椎-基底动脉血流动力学指标均明显改善,其中治疗组改善更明显(P<0.01)。结论超微针刀结合三维平衡整脊能有效改善颈性眩晕症状、椎-基底动脉血流动力学指标,效果优于针刺组。

DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建

目的 构建人DNA双链断裂 (DSB)修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料。方法 提取人胚肺成纤维细胞 (HLF)总RNA ,逆转录酶 多聚酶链式反应 (RT PCR)扩增hKu70基因cDNA保守序列 ,经与pGEM T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后 ,将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP C1中 ,筛选、克隆、抽提质粒 ,从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K。结果 经RT PCR获得 467bp含限制性内切酶位点的DNA片段 ,T载体克隆后经双酶切、测序 ,确定该片段为hKu70基因cDNA ,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,并双酶切 ,测序确证。结论 成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP C1 K ,为建立该基因低表达细胞株。

hPARP-1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆

目的 克隆及构建含限制性内切酶位点BamHⅠ、SacⅠ的人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1(hPARP 1)基因cDNA翻译起始区域的pGEM T S载体 ,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料。方法 采用RT PCR方法 ,用正常人胚肺成纤维细胞 (HLF)抽提的总RNA逆转录成cDNA ,再以cDNA为模板 ,扩增hPARP 1基因片段 ,并直接与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α ,用蓝 (白 )斑试验筛选出阳性克隆 ,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定 ,再行序列分析。结果 经RT PCR获得 5 0 7bp含限制性内切酶位点的阳性产物 ,T载体克隆、PCR及酶切鉴定和序列分析后证实 ,克隆片段与Genbank中该基因的序列同源性为 99 9%。结论 该实验成功地构建了含hPARP 1基因cDNA翻译起始区域的T载体克隆 。

BM-cyclin1上调转录因子Sp1促进TopoⅡα表达逆转肿瘤多药耐药的研究

目的:探讨BM-cyclin 1逆转人口腔上皮癌C-A120细胞多药耐药及其机制。方法:MTT法检测细胞增殖;RT-PCR及Western blot检测BM-cyclin 1对TopoⅡαmRNA、蛋白表达的影响,Western blot检测BM-cyclin 1对转录因子SP1、SP3表达的影响;报告基因法检测BM-cyclin 1对Sp1、Sp3转录调控的影响。结果:(1)BM-cyclin 1可以明显逆转C-A120细胞多药耐药:C-A120细胞对ADM、VP-16、DDP敏感性分别提高了6.0、8.2及1.7倍。(2)BM-cyclin 1明显上调TopoⅡαmRNA及蛋白表达上调。(3)BM-cyclin 1可明显诱导转录因子SP1表达并上调其转录活性。结论:BM-cyclin 1能够明显逆转C-A120细胞多药耐药性;并且这种逆转作用可能与BM-cyclin 1上调转录因子Sp1活性,增加TopoⅡα表达相关,为BM-cyclin 1进一步开发应用提供理论依据。

BM-cyclin1上调转录因子Sp1促进TopoⅡα表达逆转肿瘤多药耐药的研究

目的:探讨BM-cyclin 1逆转人口腔上皮癌C-A120细胞多药耐药的机制。方法:MTT法检测细胞增殖;RT-PCR及Western blot检测BM-cyclin 1对TopoⅡαmRNA、蛋白表达的影响,Western blot检测BMcyclin 1对转录因子Sp1、Sp3表达的影响;报告基因法检测BM-cyclin 1对Sp1、Sp3转录调控的影响。结果:(1)BM-cyclin 1可以明显逆转C-A120细胞多药耐药:C-A120细胞对ADM、VP-16、DDP敏感性分别提高了6.0、8.2及1.7倍。(2)BM-cyclin 1明显上调TopoⅡαmRNA及蛋白表达上调。(3)BM-cyclin 1可明显诱导转录因子SP1表达并上调其转录活性。结论:BM-cyclin 1能够明显逆转C-A120细胞多药耐药性;并且这种逆转作用可能与BM-cyclin 1上调转录因子Sp1活性,增加TopoⅡα表达相关,为BM-cyclin 1进一步开发应用提供理论依据。

受体组分蛋白（RCP）在静压力诱导血管平滑肌细胞增殖及跨膜信号转导中的作用

目的：探讨降钙素基因相关肽受体组分蛋白（RCP）在静压力诱导血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及跨膜信号转导中的作用。方法：以鼠源性A10血管平滑肌细胞（A10VSMC）作为研究对象，用不同静态压力（0，80，100，120，140，160，180mmHg）在不同时间（0，