耐高温酿酒酵母的构建与高温耐受机制解析

旨在构建优良的高温耐受酿酒酵母菌株,并探究其高温耐受机制。通过CRISPR/Cas9技术在絮凝性工业酿酒酵母KF-7中敲除ASP3(编码L-天冬酰胺酶II)并进一步高表达CRZ1(编码具有锌指结构的转录因子Crz1p),通过比较转录组解析重组菌株的高温耐受机制。结果显示,在44℃高温条件下,ASP3敲除菌株KAS11利用98.36 g/L葡萄糖产生43.68 g/L乙醇。在KAS11基础上高表达CRZ1后,菌株KASCR7发酵105.37 g/L葡萄糖产48.02 g/L乙醇。与KF-7相比,两个重组菌株的乙醇产量分别提升了4.77%和15.18%。比较转录组分析结果表明,在高温胁迫下,重组菌株的核糖体生物合成及翻译相关基因受到抑制,而热休克蛋白基因以及NAD~+、NADH、嘌呤、甘油、脯氨酸等合成相关基因受到诱导,这些响应可能共同导致重组菌株的高温耐受性提升。研究结果可为构建高温耐受酿酒酵母菌株提供优良菌株资源和理论基础。

常压室温等离子体诱变选育黄原胶生产菌

以野油菜黄单胞菌为出发菌株,进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选产黄原胶的优良菌株。研究结果表明:以菌落直径为初筛指标,共获得5株诱变菌株;进一步以黄原胶产量和黏度为复筛指标,获得1株优良菌株X20。其黄原胶产量与黏度分别为3.52 g/L和77.30 mPa·s,比出发菌株分别提高77.78%和40.03%。经过10次传代培养,诱变菌X20具有较好的遗传稳定性。不同环境因子都会影响X20的发酵性能。以谷氨酸为氮源时,黄原胶产量及黏度均最高,分别为7.30 g/L和495.50 mPa·s,比出发菌分别提高43.27%和22.29%。高质量浓度谷氨酸(大于1 g/L)会显著抑制出发菌株和X20的发酵液黏度,4 g/L谷氨酸使其黏度分别降低至21.8 mPa·s和25.93 mPa·s。不同初始pH条件下X20的黄原胶黏度均高于出发菌株,且X20更适应pH 6.5的发酵环境,黏度可达546.5 mPa·s。随着盐度增加,诱变菌株的黄原胶产量增加、黏度下降,且都高于出发菌株。当盐度为8 g/L时,X20的黄原胶产量和黏度分别为12.19 g/L和331.23 mPa·s,比出发菌株分别高23.05%和109%。X20的发酵液黏度在不同温度(20℃~80℃)及高矿化度(28.90 g/L)条件下均保持稳定,且始终优于出发菌株,具有一定的工业应用潜力。

“新工科”背景环境工程微生物学实验模块化教学

针对目前四川大学“环境工程微生物学实验”教学中所存在的问题,借鉴其它高校的改革方式,提出了对实验课实施模块化教学改革的思路。在原有实验的基础上,将实验内容设计成“环境微生物形态及结构观察”、“功能微生物的分离纯化,鉴定及培养条件优化”、“水质微生物检测”及“环境微生物的群落结构分析”四个模块。每个模块分别锻炼学生的验证、综合、应用及研究能力;各模块内的单元实验注重连续性,各模块间的内容相互呼应又非完全独立,起到了巩固和提高微生物学基础实验技术的效果。通过建立本科实验室-专业实验室联合教学模式、网络信息化教学平台、多元化考核方式以及研究生助理岗位作为辅助化教学手段,以提升整体的教学质量和效果。

产黄青霉废菌体对铅的吸附机理研究——参与铅生物吸附的化学物质及功能团的确定

对产黄青霉废菌体对废水中Pb2 +的生物吸附机理进行了研究 ,主要探讨了参与吸附的细胞组分及化学功能团。对菌体的化学处理及红外光谱分析结果表明 :经脱蛋白、脱脂及脱乙酰化预处理的菌体对Pb2 +的吸附量明显增大 ;产黄青霉废菌体对Pb2 +的吸附主要发生在产黄青霉菌细胞壁上 ;细胞壁的主要成分几丁质和葡聚糖均参与了吸附过程 ;酰胺基团 (-NHCOCH3)和羟基基团 (-OH)协同作用结合Pb2 +,Pb2

产黄青霉废菌体对铅的吸附机理(Ⅱ)——铅生物吸附途径和吸附类型的确定

探讨了铅生物吸附途径和吸附类型。X射线衍射分析及离子竞争及洗脱实验结果表明 ,产黄青霉废菌体对Pb2 +的吸附途径有 2个 :第 1,Pb2 +与一些细胞自溶物或细胞碎片结合 ,沉积在吸附剂颗粒表面 ,这些沉积物具有晶体结构 ,此部分吸附量最大可占总吸附量的 5 3% ;第 2 ,Pb2 +与菌体表面结合位作用 ,进行离子交换吸附 ,Pb2 +与[H+/ 2 +Ca2 ++Mg2 +]等量置换 ,其中以离子键形式进行的吸附至少占离子交换吸附总量的 2 5 % ,其余主要为以共价 /配位键形式存在的化学吸附。

生物吸附研究进展

生物吸附法是目前处理含金属废水的一种较有效的方法 ,特别是对于低浓度废水的处理优势明显。生物吸附法处理废水亦可达到以废治废的目的。本文就生物吸附领域目前研究状况进行了概述 ,主要包括了生物吸附剂对金属离子的吸附作用。

耐高温絮凝酵母HK-3糖蜜原料发酵生产酒精特性

在机械搅拌罐内，以糖蜜为原料，对原生质作融合法构建的耐高温絮凝酵母HK－3的发酵特性进行了研究。利用正交实验法，考察了通气、搅拌和初糖浓度对发酵的影响。在38℃，100r／min，0.3vvm通气量，19％初糖浓度的最优工艺条件下间歇发酵，酵母数、酒精浓度、综合生产能力、原料利用率、乙醇收率分别可达2．8亿／ml、10．56％、3．7g乙醇／L／h、86．67％、98％，很有工业推广价值。与亲本KF－7的连续发酵结果表明，该融合子的发酵稳定性需进一步改善。

黄河三角洲湿地土壤微生物群落结构分析

采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术和16S rDNA克隆文库的方法,分析了黄河三角洲滨海湿地土壤不同深度细菌和古菌的群落结构.研究表明,随着深度的增加,细菌群落的多样性下降,而古菌群落多样性则有上升的趋势,且土壤的细菌和古菌群落结构都呈现出规律的层状分布.该土壤包括各种硫酸盐还原菌、产甲烷古菌、光合细菌等丰富的细菌和古菌资源.

两株假单胞菌降解酚类化合物的特性

从焦化废水中分离得到2株可降解对氯酚的假单胞菌(Pseudomonas)CO-1和CO-44.其最适降解温度为35～40℃,最适pH值为6.0～8.0.菌株降解对氯酚的速度与对氯酚初始浓度呈负相关.2株细菌均能较快地降解苯酚和甲酚,其中CO-1还能够降解1-萘酚和萘.在添加对氯酚的焦化废水中,CO-1和CO-44能够在42h内将苯酚、甲酚和对氯酚完全降解.从2株细菌中均检测到了苯酚羟化酶基因,分别从菌株CO-1和CO-44中检测到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因和邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.

固定化产黄青霉废菌体吸附铅与脱附平衡

研究固定化产黄青霉废菌体对Ｐｂ２＋的吸附与脱附平衡的结果表明，Ｐｂ２＋的生物吸附受ｐＨ值的影响很大，温度的影响则很小．ＥＤＴＡ是洗脱固定化产黄青霉废菌体上所吸附Ｐｂ２＋的最佳脱附剂．在保持脱附率为１００％的条件下，ＥＤＴＡ的初浓度、固定化废菌颗粒的吸附量与最大固液比之间存在正相关关系．０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ在脱附Ｐｂ２＋时终浓度最高可达２０７００ｍｇ／Ｌ，最大固液比可达２９０以上，浓缩因子可达１１３。

PVA混合载体固定化枯草杆菌的研究

用ＰＶＡ作为基础载体，固定化枯草杆菌Ｎ＿２－９３，在机械搅拌罐内发酵，生产α－淀粉酶，同时添加部分海藻酸钠以改进载体扩散性能。考察了载体浓度及配比对固定化细胞载体性能、机械强度及产酶特性的影响。结果表明，添加少量海藻酸钠的ＰＶＡ载体具有较好的传质效果及机械强度。在５Ｌ搅拌发酵罐中连续发酵，最佳稀释率可达１．０ｈ（－１），连续发酵酶活保持在２７０μ／ｍ以上，载体无溶胀，破碎现象。

Cr(Ⅵ)抗性菌株的筛选及其Cr(Ⅵ)去除特性研究

采用微生物分离纯化方法,从制革厂含铬污泥中筛选分离Cr(Ⅵ)抗性菌株,并研究菌株对Cr(Ⅵ)的去除能力。共分离得到对50mg/LCr(Ⅵ)去除率大于50%的菌株20株,16S rRNA基因测序结果表明这些细菌主要属于Acinetobacter、Microbacterium、Leucobacter、Ochrobactrum和Brachymonas属。对其中7株细菌,考察了菌株生长期、pH值和Cr(Ⅵ)浓度对菌株去除Cr(Ⅵ)效果的影响,结果表明,细胞在有较高代谢活性的条件下具较高的Cr(Ⅵ)去除能力;pH值对菌株去除Cr(Ⅵ)的能力具有显著影响,在50mg/LCr(Ⅵ)、pH值为7～8的条件下,Microbacterium属16号和21号菌株在36h时对Cr(Ⅵ)的去除率达80%～95%;高浓度的Cr(Ⅵ)抑制菌株对Cr(Ⅵ)的去除能力,其中21号菌株在110mg/L的Cr(Ⅵ)浓度下去除效果最佳,Cr(Ⅵ)去除率达80%。

油菜秸秆比例对好氧堆肥过程及产品特性的影响

采用堆肥工艺将农作物秸秆转化为有机肥还田是秸秆资源化利用的有效手段.本研究以油菜秸秆为主要原料,按不同比例同辅料混合(三组实验R1、R2和R3中的油菜秸秆比例(湿重)分别为45%、65%和85%),研究了油菜秸秆比例对高温好氧堆肥过程及产品特性的影响.结果表明,在72d的堆肥过程中,R1、R2和R3的有机物降解主要发生在堆肥过程前期,堆肥结束时分别达到34.06%、35.57%和39.78%.通过比较三组实验过程中样品的理化性质,可知R3最终样品满足了堆肥腐熟的各项指标,且堆肥过程中氮损失最少;其最终堆肥产品中未检测出NH_4^+,总N含量、NO_3^-浓度和GI值分别达到2.17%、1,844.93mg·kg^(-1)干重和102.66%.

耐温絮凝酵母Saccharomyces cerevisiae KF-7的细胞活性及发酵特性研究

本文通过不同温度下对絮凝酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＦ－７胞内储存糖含量、有机酸综合值ＯＳＲ及发酵性能的分析研究，探讨了絮凝酵母的耐温性及细胞活性。研究结果表明：酵母细胞的耐温性及细胞活性与细胞内的海藻糖含量密切相关；酵母分泌的有机酸综合值ＯＳＲ可以直观反映酵母细胞活性；在一定温度范围内，低温有利于酵母增殖，高温有利于酒精发酵；提高发酵温度可以提高酵母活性，增加出酒率。发酵试验结果表明絮凝酵母ＫＦ－７为一株性能优良菌株。

以玉米为原料采用耐温絮凝酵母发酵产生酒精的研究

本文将细胞融合法所得的耐温絮凝酵母用于以玉米为原料的酒精发酵。对该酵母的耐温性能进行了考察，讨论了供氧对酵母生长、酵母活性及发酵结果的影响，并在同等条件下与非絮凝酵母进行了比较。实验结果表明，耐温絮凝酵母的最适发酵温度为３３～３５℃，适量供氧可提高酵母活性及发酵速率，即使在不通气条件下，发酵醪中酵母浓度达３亿／ｍｌ左右，间歇发酵时间为１９ｈ，单罐生产能力４．５ｇ／１·ｈ，发酵率约９０％。与国内工厂使用的Ｋ字酵母比较可见，该耐温性絮凝酵母是一种可以直接开发应用于工厂的优良菌株。

酶添加对酿酒废糟干式厌氧消化产沼气效果的影响

酿酒废糟是白酒生产过程的主要副产物,其处理及资源化利用是亟待解决的问题。该研究拟采用干式厌氧消化技术处理日益增加的酿酒废糟,同时生产生物能源沼气。为了提高沼气产量,探讨了酶添加对酿酒废糟高温干式厌氧消化效果的影响,并监测了厌氧消化过程中污泥pH值,有机酸(volatile fatty acids,VFAs),可溶性有机碳(soluble total organic carbon,TOC)等系统参数的变化情况。结果表明,直接利用酿酒废糟进行干式厌氧消化,系统启动初期有有机酸积累,稳定发酵条件下的沼气产量约为270.7 m L·g^(-1)VS。向酿酒废糟厌氧消化过程中添加淀粉酶、糖化酶和纤维素酶能够显著促进沼气产量,沼气产率提高到337.6 m L·g^(-1)VS,有机酸浓度保持在较低的水平。分别对两体系中细菌和古菌16S rRNA基因进行定量PCR,结果表明,酶添加体系同对照相比参与厌氧消化过程的微生物数量显著增加。

利用原生质体融合技术构建耐酸絮凝性产乙醇酿酒酵母

为获得具有多种优良性状的高效乙醇生产菌株,以絮凝性酿酒酵母RHZ-1及耐酸耐温酿酒酵母SEB2为亲本,通过紫外诱变获得营养缺陷型标记菌株,并利用原生质体融合技术选育耐酸絮凝性酿酒酵母。通过对融合子的筛选获得一株优秀的耐酸絮凝性酿酒酵母菌株RS-1;该菌株在30℃,pH2.2,15%YPD条件下发酵24 h,乙醇产生量为47.87 g/L,糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率分别比亲本菌株RHZ-1提高了19.5%和9.8%。在35℃,p H2.2,15%YPD条件下发酵48 h,乙醇产生量为38 g/L,糖消耗速率和乙醇收率分别比亲本菌株RHZ-1提高了46.8%和21.6%。结果表明,获得的菌株可为提高燃料乙醇的生产效率奠定基础。

油井采出液中微生物群落结构的T-RFLP分析

应用末端标记限制性片段长度多态性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)和克隆文库分析,以微生物群落16SrRNA基因(16S rDNA)为目标,对大庆油田过渡带油井采出液(于2005年7月和10月取样)中的微生物群落结构进行了解析和比较。T-RFLP分析表明,2005年7月和10月油井采出液中古菌群落结构较为单一,随时间变化不大;而细菌群落结构较为复杂,不同时间群落中的优势菌有明显的差别。古菌和细菌16S rDNA片段测序和系统发育分析表明,大庆油田过渡带油井采出液古菌群落中的优势菌均为产甲烷菌;细菌群落中的优势菌则与β、γ、δ、ε变形杆菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacte-roidetes)和脱铁杆菌(Deferribacteres)有较高的相似性,细菌群落中检出了大量的未培养微生物(Deep-branching lineages)。

紫外诱变驯化提高酿酒酵母木糖发酵的抑制物耐受性

利用驯化和紫外处理结合驯化的手段对一株木糖发酵工业菌株的抑制物耐受性进行提升。在反复批次培养过程中不断提高含9种抑制物的混合抑制物浓度,使细胞的生长和发酵逐渐适应高浓度抑制物环境,分离突变菌株并进行评价。紫外处理结合驯化比直接驯化能更有效的提升细胞对高浓度抑制物的耐受能力;通过突变菌株分离和筛选,获得3株抑制物耐受能力高于出发菌株的突变菌株,它们在抑制物浓度100%MI(甲酸1 g/L,乙酸3.5 g/L,乙酰丙酸1.5 g/L,糠醛1.5 g/L,5-羟甲基糠醛1.5g/L,丁香醛0.1 g/L,香草醛0.1 g/L,松柏醛0.025 g/L,肉桂酸0.025 g/L)条件下的木糖消耗率比出发菌株高出11.3%-23.2%。紫外诱变处理结合驯化过程可以有效提高酿酒酵母对混合抑制物的耐受性。

丁酸和戊酸互营氧化产甲烷微生物学研究进展

丁酸和戊酸是产甲烷过程中重要的中间代谢产物,特别是在含蛋白废水的厌氧消化体系中,丁酸和戊酸是主要的中间代谢产物。研究互营丁酸和戊酸氧化分解的微生物学对于含蛋白废水的处理乃至厌氧消化体系稳定高效运行都是极其重要的。文章总结了目前已分离获得的丁酸和戊酸氧化菌,介绍了已知的丁酸和戊酸的氧化分解途径,同时概述了关于丁酸和戊酸互营氧化分解相关的微生物群落研究现状,对利用丁酸和戊酸产甲烷的微生物学研究的未来发展提出了建议。