人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究

通过PCR法直接克隆了 2 .36 6kb的人乳铁蛋白基因cDNA序列及 80 0bp的山羊 β.M乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,并连接到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA的重组质粒pLNCXHLF ,并导入到小鼠乳腺癌细胞株MA.M 782中 ,G418及PCR筛选获得阳性单克隆细胞 ,增殖后 ,转染细胞利用海藻酸钠固定化包埋培养 ,经激素诱导 ,培养液上清通过Western印记检测证明 ,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白 ,分子质量为34kDa;ELISA法测出 ,每升培养基 (含 10 5个细胞 )重组蛋白最高表达量为 6 5mg ;抗菌实验表明 ,所获得的重组人乳铁蛋白具有抑制大肠杆菌生长的作用 ,而且比人乳铁蛋白标准品作用更强。

应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展

各种建立在PCR基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种:反向PCR的方法,连接法介导的PCR的方法以及特异引物PCR的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。

形目15种鸟类线粒体ND6基因序列差异及其系统进化关系

采用PCR和质粒克隆测序方法 ,首次获得形目 15种鸟类线粒体基因组的ND6基因全长 5 2 2bp的序列。经对位排列 ,序列间未见有插入和缺失 ,共有 2 16个变异位点 ,种间序列差异为 5 17%～ 19 92 %。以白鹳为外群 ,用NJ法构建 15种鸟类的进化关系树。研究结果表明 :构建的系统树将形目 15种鸟类分为 2个支系。第 1支系包括蒙古沙、环颈、灰斑和反嘴鹬。第 2支系包括红脚鹬、林鹬、青脚鹬、翘嘴鹬、翻石鹬、大滨鹬、尖尾滨鹬、斑尾塍鹬、中杓鹬、大杓鹬和白腰杓鹬 ,其中鹬属的 3个种和杓鹬属的 3个种分别组成一个单系 ;翘嘴鹬和翻石鹬、大滨鹬和尖尾滨鹬分别聚为姊妹群 ,表现出较近的亲缘关系 ;斑尾塍鹬独立分支出来。分子证据提示 :鹬科中的塍鹬属、科中的斑属应提升为亚科分类阶元 ;反嘴鹬与科鸟类亲缘关系较近 ,组成一个单系 ,将其归入科下属的一个类群更为合理 ,与核型研究结果及Sibley新分类体系的观点相一致 [动物学报 49(1) :6 1～ 6 7,2 0 0 3]。

日本七鳃鳗(Lampetrs japonica)唾液腺cDNA文库的构建

以水生动物日本七鳃鳗唾液腺为材料,应用Gubler和Hoffman技术方法,构建以pBluescriptⅡSK(+)载体为基础的日本七鳃鳗唾液腺cDNA筛选文库.通过对文库的鉴定,文库的库容量为1.5×106转化子/μgcDNA,插入片段的平均长度为1.0kb.该文库保留了日本七鳃鳗唾液腺中蛋白质的分子信息,为进一步研究其组分和作用机理奠定了基础.

鸟类线粒体DNA研究概述

线粒体DNA作为理想的分子标记已被广泛用于鸟类种群遗传学和进化遗传学的研究 ,并取得了许多有意义的结果。本文介绍鸟类线粒体DNA的组成、结构特点及多态性的研究 ,综述近年来有关鸟类分子进化研究的进展情况 ,对今后的发展进行了初步的探讨。

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过 PCR法扩增出 2 366bp的人乳铁蛋白 c DNA、80 0 bp的山羊β -乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,经 PCR反应连接后 ,克隆到表达载体 p LNCX中 .测序结果表明 :与 Gene Bank中登录的序列相比 ,所获人乳铁蛋白 c DNA序列的同源性为 99.74 % ,山羊β -乳球蛋白基因 5′端调控序列的同源性为 99.75% .酶切结果证明得到了正确的重组载体 ,可用于乳腺生物反应器的研究 .利用 PCR反应直接克隆目的片段 ,并通过同源序列进行 PCR连接 ,极大提高了克隆的速度和准确性 ,为基因克隆及其表达研究带来了方便 .

猛禽类15种鸟类线粒体tRNA基因序列及二级结构的比较研究

利用PCR方法扩增 13个猛禽类物种线粒体基因组中 3个主要的tRNA基因簇 :IQM (tRNAIle tRNAGln tRNAMet)、WANCY (tRNATrp tRNAAla tRNAAsn tRNACys tRNATyr)和HSL (tRNAHis tRNASer(AGY) tRNALeu(CUN) ) ,测序后结合GenBank已登陆的游隼和普通相应序列探讨猛禽类共 15种鸟类的分子系统进化。 3个目的片段长度分别为2 12～ 2 14bp、35 3～ 36 2bp、2 0 5～ 2 0 8bp ,通过比较这些tRNA基因序列和二级结构差异 ,发现可变核苷酸位点占47% ,这些变异中 6 7%出现在环区 ,且存在插入和 (或 )缺失。茎区相对保守 ,其中一些变异如双链的互补性碱基突变、G U配对等对于维系tRNA二级结构的稳定性非常重要。以夜鹰为外群分别构建了 15个猛禽类物种共 11个线粒体tRNA基因全序列和茎区序列的NJ树和MP树 ,其中基于全序列的系统发育树分支具有较高的自引导值 ,因此该数据集所反映的猛禽类系统发育关系可能更接近真实水平。系统发育分析显示 ,隼形目鹰科更接近于鸱科而不是隼科 ,而草科的分类地位也与传统的形态学和DNA DNA杂交数据的结论存在分歧。比较物种间tRNA基因二级结构发现 ,部分tRNA基因中的核苷酸插入和缺失特征在科水平具有共同衍征 ,提示这些特征对于猛禽类科间系统发育关系具有较高的参考价值。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

形目12种鸟类线粒体细胞色素b基因序列差异及其系统发育关系

采用PCR直接测序方法首次对形目 (Charadriiformes) 12种鸟类 :蒙古沙 (Charadriusmongolus)、环颈(Charadriusalexandrinus)、大杓鹬 (Numeniusmadagascariensis)、白腰杓鹬 (Numeniusarquata)、中杓鹬 (Numeniusphaeo pus)、红脚鹬 (Tringatotanus)、林鹬 (Tringaglareola)、翘嘴鹬 (Xenuscineres)、翻石鹬 (Arenariainterpres)、大滨鹬 (Calidristenuirostris)、反嘴鹬 (Recurvirostraavosetts)和砺鹬 (Haematopusostralensis)线粒体cytb基因全序列进行测定 ,并以白鹳(Ciconiaciconia)的同源序列作为外群构建系统发生树。经比对 ,形目 12种鸟类线粒体cytb基因全序列均包括1143bp ,序列间未见有插入和缺失 ,共有 381个变异位点 ,种间序列差异值为 5 16 %～ 16 0 1%。重建的系统树将形目 12种鸟类分为 2个支系 :第 1支系包括红脚鹬、林鹬、翻石鹬、大滨鹬、翘嘴鹬、中杓鹬、大杓鹬和白腰杓鹬 ,其中红脚鹬、林鹬、翻石鹬、大滨鹬、翘嘴鹬聚为一支 ,中杓鹬、大杓鹬和白腰杓鹬聚为另一支 ;第 2支系包括蒙古沙、环颈、反嘴鹬和砺鹬 ,其中反嘴鹬与砺鹬互为姐妹群 ,然后再与属的两个种蒙古沙和环颈组成的姐妹群构成并系群。分子证据提示 :第 1支系中各属间及种间的系统关系与形态学研?

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA 5′末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物,应用"去帽法"原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA 5′端未知序列.测序结果表明,扩增出的5′端未知序列长度为421 bp.通过与已知的CDS区序列比对,确定扩增出的5′端未知序列就是目的序列,其5′端非编码区长度为61 bp.

微量RNA的cDNA PCR文库的构建

使用PCR（polymerase chain reaction）技术，调制了mRNA的cDNA PCR文库，实验证明，cDNA PCR文库能使原cDNA的量放大数百倍。同时，使用人体K562培养细胞的总RNA，对cDNA PCR文库法和反转录中的β-Actin的cDNA量进行了比较，cDNA PCR文库法中的β-Actin的cDNA量大大高于反转录中的β-Actin的cDNA量。使用75pg的人体K562培养细胞的总RNA，调制成50μl的cDNA PCR文库，使用1μl的cDNA PCR文库进行PCR反应时，可对文库中的β-Actin的cDNA进行PCR检测。因此，cDNA PCR文库显示了良好的信息放大性能。

一种高效的功能基因分离解析法

人类基因组计划 (HumanGenomeProject)的实施揭开了各种生物基因组解析的序幕[1～ 3 ] 。随着各种生物的基因组解析的顺利进行 ,遗传基因的功能研究以及寻找新的功能基因变得越来越重要。本文介绍的Mega cloneTM技术、MegasortTM技术[4 ] 以及MPSS 技术[5] 可以高效地分离解析各种功能基因。

鸮形目两种鸟类线粒体基因组全序列测定与比较研究

利用Long-PCR和PrimerWalking结合克隆测序法对短耳鸮和长耳鸮线粒体基因组进行了全序列测定.结果表明:短耳鸮mtDNA序列全长为18858bp,长耳鸮mtDNA全长为18493bp,其中短耳鸮mtDNA是目前已知最长的鸟类线粒体基因组.两种鹗类的基因组结构和基因排列顺序与家鸡相同,无假控制区,在ND3基因174位点都存在一个额外插入的胞苷酸(C).控制区序列异常增大是造成这两种鸟类mtDNA增大的主要原因,短耳鸮控制区长度为3288bp,长耳鸮为2926bp,这是目前已知的脊椎动物线粒体基因组中仅次于盲鳗的最大的控制区.在其控制区3'端存在大量的串联重复序列,分析发现这两种鸮类的重复序列和Mt5调控元件有较高的序列相似性,且能形成多重的茎环二级结构,这表明该重复序列可能具有一定的生理功能,影响线粒体基因组的复制或转录表达,从而使相应物种具有更大的选择优势,以适应环境和生存竞争.