小麦条锈菌效应蛋白Hasp83在条锈菌致病性中的功能分析

【背景】条锈病是小麦上的重大病害,由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器从寄主植物汲取营养。同时,吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫,促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理,为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组,获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死;利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白,免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp,编码173个氨基酸,蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽,无保守结构域,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达能抑制由BAX引起的细胞坏死。qRT-PCR分析显示,Hasp83在条锈菌侵染时期上调表达;利用细菌Ⅲ型分泌系统在小麦水源11品种中瞬时表达Hasp83能够抑制荧光假单胞菌引起的胼胝质积累,在接种条锈菌无毒性小种CYR23后,瞬时表达Hasp83株系产生的活性氧积累面积和过敏性坏死面积相比对照减少19.35%—38.62%;利用HIGS技术在接种条锈菌毒性小种CYR31的小麦水源11中沉默Hasp83,发现条锈菌的产孢量、菌丝长度、菌丝扩展面积和吸器数目减少,致病力降低。酵母双杂交结果表明,效应蛋白Hasp83与其小麦中候选靶标过敏性坏死诱导蛋白Tahir1互作。免疫共沉淀进一步证明Hasp83及其候选靶标Tahir1存在互作。【结论】条锈菌效应蛋白Hasp83可抑制寄主由非致病细菌和无毒性条锈菌生理小种引起的小麦防卫反应,增强病原菌的致病力。

蛋白激酶TaPiPK1在小麦抗条锈病反应中的功能分析

由条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp.tritici(Pst)引起的条锈病,长期严重威胁小麦安全生产。Pst通过毒性变异产生新毒性小种或致病类型,能克服生产上已应用的抗病基因,导致抗病品种感病。因此,挖掘抗条锈病基因资源对小麦抗病遗传改良和加快抗病新品种培育具有重要意义。蛋白激酶在应答病原菌侵染,传递植物免疫信号中发挥重要作用。本研究通过小麦转录组数据分析,筛选到参与应答Pst、小麦白粉菌Blumeria graminis f. sp.tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum侵染的蛋白激酶基因TaPiPK1。该蛋白激酶基因编码551个氨基酸,C末端含有一个STK激酶结构域。利用RT-qPCR检测发现,TaPiPK1在小麦与条锈菌非亲和互作的前期上调表达;TaPiPK1主要定位于细胞质与细胞膜。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)瞬时沉默TaPiPK1,显著降低小麦‘水源11’对条锈菌非亲和小种CYR23的抗性,表明TaPiPK1参与小麦抗条锈病反应并发挥重要作用。因此,TaPiPK1有可能作为潜在的基因资源用于小麦抗条锈病育种。

基于LSH的时间子序列查询算法

子序列的相似性查询是时间序列数据集中的一种重要操作,包括范围查询和k近邻查询.现有的大多算法是基于欧几里德距离或者DTW距离的,缺点在于查询效率低下.文中提出了一种新的基于LSH的距离度量方法,可以在保证查询结果质量的前提下,极大提高相似性查询的效率;在此基础上,给出一种DS-Index索引结构,利用距离下界进行剪枝,进而还提出了两种优化的OLSH-Range和OLSH-kNN算法.实验是在真实的股票序列集上进行的,数据结果表明算法能快速精确地找出相似性查询结果.

一种基于增长模式的交易序列聚类算法

对交易序列进行各种挖掘分析能为商家制定营销策略提供量化依据.文中从销售量及变化趋势角度研究交易序列数据集的内在结构,定义了一种反映价格变化趋势的增长模式及其错位组合距离和角度向量距离两种相似性度量,在此基础上设计一个考虑时限约束的目标函数进行聚类研究.实验数据采用真实的商品交易序列集,结果表明,在时限约束的条件下,增长模式这种特征提取方式及其模式间的两种距离函数能较好地产生聚类结果,且这些聚类结果能得到较好地解释.

一种序列模式的相似性查询算法

数值型序列在很多应用中存在,如超市的POS销售记录和证券交易所的股票买卖数据等.在此类数据中查询与给定序列模式相似的子模式具有重要的现实意义.提出一种趋势融合的序列相似性查询算法NSS_QA,首先对所有序列进行单调区间的"融合"处理,然后根据各区间的长度比例和幅度比例产生序列模式的候选集,最后定义了一种新的相似性度量来计算并返回查询结果.该查询算法能找到与给定序列模式"放大"或"缩小"的模式结果.实验结果表明,提出的算法能找到在总体形状上与给定序列模式相似的所有模式,且在时间上具有较好的伸缩性能.

化危为机

<正>中国的民营企业发端于上个世纪70年 代末80年代初,经过20余年的发展,涌现出一批较为出色的企业,但从总体来说,成功的企业很少。据相关调查研究,内地的民营企业平均存活寿命约5年7个月。特别是自90年代中期以来,一批名声显赫的民营企业纷纷落马。究其原因,重要的一条就是缺乏对企业发生危机的预防和发生危机后的有效应对策略。在加入WTO的今天,中国的民营企业面临着跨国公司的竞争,因此深入了解民营企业危机管理的因应之道,就显得愈加重要和迫切。 民营企业对危机 管理失败的教训 民营企业在其发展的过程中,存在着一些极其相似的弊端,如经营业务盲目多元化,经营战略严重失误,内部管理特别是财务管理较为混乱以及过分注重营销、

小麦条锈菌致病性及其变异研究进展

小麦条锈病(wheat stripe rust or yellow rust)是一种气传性的低温真菌病害,在所有小麦产区均可暴发流行,造成巨大的产量和经济损失,严重威胁着小麦的安全生产。其病原条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici Eriks.&Henn.,Pst)为严格专性寄生真菌,致病性变异频繁,常造成小麦品种抗条锈性"丧失",引发病害大流行。因而,从20世纪50年代起,条锈菌致病性变异的研究一直备受关注,并已开展了大量的研究工作。本文从小麦品种抗病性丧失、条锈菌致病性变异途径、条锈菌群体遗传、条锈菌基因组和功能基因组以及条锈菌效应蛋白等不同方面概述了近年来取得的重要研究进展,提出了未来条锈病防治上面临的问题和挑战;以期通过准确预测条锈菌优势小种、合理利用和布局抗病基因、利用新策略创制新型持久广谱抗病材料,不断优化和完善小麦条锈病综合治理技术体系,实现小麦条锈病可持续控制。

小麦钙调素新亚型TaCaM5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术,从条锈菌诱导的小麦叶片中分离出一个编码CaM基因的cDNA序列,经氨基酸序列分析确定其为一个新的小麦CaM亚型,暂被命名为TaCaM5。TaCaM5包含一个完整450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸;编码的蛋白不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,具有4个EF-hand保守结构域。在目前已知的CaM基因中,TaCaM5与玉米CaM基因的亲缘关系最近,相似性高达97%。该基因在根、茎、叶等组织中均有不同程度的表达;并且受条锈菌诱导表达,在非亲和组合与亲和组合中,分别在接种后6h和24h表达量最高。外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯诱导TaCaM5上调表达,水杨酸诱导其下调表达。TaCaM5在机械伤害、干旱和低温条件下表达量上升,在高盐环境下表达量降低。表明TaCaM5可能通过茉莉酸和乙烯等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与机械伤害、低温和干旱环境下的Ca2+-CaM信号转导途径。

基于整体和局部相似性的序列聚类算法

现有的很多序列聚类算法是基于"局部特征可以表征整个序列"的假设来进行的,即不区分实际应用中序列的整体相似性和局部相似性.这对存在保守子模式的序列,如DNA和蛋白质序列是适用的,但对一些注重整体序列相似性的应用领域,如:在交易数据库中用户购买行为的比较,时间序列数据中全局模式的匹配等,由于难以产生频繁子模式,用基于全局相似性的度量方法进行聚类显得更为合理.此外,在基于局部相似性的序列聚类算法中,选取的局部子模式表征序列的能力也有待进一步提高.由此,针对不同应用领域,分别提出基于整体相似性的序列聚类算法GSClu和基于局部相似性的序列聚类算法LSClu.GSClu和LSClu分别利用带剪枝策略的二分k均值算法和基于有gap约束的强区分度子模式方法对各自领域的序列数据进行聚类.实验采用交易序列数据和蛋白质序列数据,实验结果表明,GSClu和LSClu对各自领域的序列数据具有较快的处理速度和良好的聚类质量.

一种优化多重过滤的序列查询算法

序列数据一类重要的数据类型,在文本、Web访问日志文件、生物数据库等应用中普遍存在,对其进行相似性查询是一种获取有用信息的重要手段.在大型序列数据库中进行高效相似性查询的关键因素之一就是查询算法的过滤能力,即设计能快速过滤与查询序列不相关序列集的过滤器十分重要.提出了结合序列距离的度量性质和序列自身特征的多重过滤算法SSQ_MF,SSQ_MF使用了长度过滤器、前缀过滤器和基于参考集的过滤器,使得算法过滤能力较基于单一过滤器算法进一步增强.此外,设计了有关数据结构对查询数据库的一些统计信息进行了预计算和保存,有效估计了各过滤器的过滤集大小,并构建了一个由过滤集大小确定的最优过滤顺序模型,使得算法的过滤代价最低.实验结果表明,算法SSQ_MF的查询性能优于单一过滤器算法和随机过滤顺序的多过滤器算法.

条锈菌诱导的小麦TaOZR的克隆及特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。

条锈菌诱导的小麦TaHin1的克隆与表达特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著,在小麦与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源植物激素水杨酸、茉莉酸诱导TaHin1上调表达,脱落酸诱导其下调表达,而乙烯不诱导其表达;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调表达。【结论】首次克隆到一个受条锈菌诱导的小麦TaHin1,可能通过水杨酸、茉莉酸信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,而脱落酸在防御反应中起负调控作用,该基因在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。

小麦转录因子基因TabZIP20的克隆及其在小麦-条锈菌互作中的表达

bZIP转录因子已经在多种植物中被报道广泛参与抗病,但是对于bZIP转录因子在小麦与条锈菌互作过程中的抗病机制的研究很少。因此,通过电子克隆及RT-PCR方法从条锈诱导的小麦水源11中克隆得到一个具有1 005bp完整ORF,编码334个氨基酸,且具有bZIP保守结构域的小麦TabZIP转录因子基因。将该基因和拟南芥的基因组比对发现其和AtbZIP20相似度最高,故命名该基因为TabZIP20。通过转化洋葱表皮细胞发现该基因编码的蛋白定位于细胞核;利用实时定量PCR分析了该基因在小麦与条锈菌亲和与非亲和组合中的表达情况,结果表明该基因在小麦对条锈菌的抗病反应中受条锈菌诱导表达。可见,TabZ-IP20参与小麦对条锈病的抗病反应,但具体作用机制仍待研究。

小麦条锈菌吸器分离方法研究

[目的]从小麦条锈菌侵染的叶片中分离纯度较高且结构较完整的吸器。[方法]根据锈菌吸器表面含有可以与伴刀豆球蛋白凝集素(Concanavalin A)结合的糖类物质的特性,参照蚕豆锈菌吸器的分离方法对小麦条锈菌吸器进行了分离。[结果]从被条锈菌侵染小麦叶片中成功分离出条锈菌吸器,提取吸器的纯度为83.3%,提取率为5.0×105个/g小麦叶片鲜重。[结论]根据蚕豆锈菌吸器的分离方法,稍作改进,成功分离得到小麦条锈菌吸器,为小麦条锈菌功能基因组学及其致病机制的研究奠定了基础。

一种时序组合模式挖掘算法

序列模式挖掘是发现特征的重要方法之一。目前运用于时间序列模式的方法有两类,一种是基于相对时间的离散化模式查询,另一种是基于连续时间的原始时间模式查找。结合目前两种主流算法,提出了频繁同类异构模式算法和频繁异类组合模式算法,并使用图挖掘算法和聚类算法执行快速收敛。实验结果表明,提出的算法运行效率高,同时能够找到扩展性更强,适用性更广的频繁时间序列模式。

小麦TaCTSB基因在小麦-条锈菌互作中的功能研究

为明确小麦组织蛋白酶B基因TaCTSB在小麦与条锈菌互作中的功能,采用PCR技术扩增获得TaCTSB基因的完整编码区序列;通过qRT-PCR技术检测TaCTSB基因的表达情况;利用农杆菌介导瞬时表达体系在烟草叶片上进行亚细胞定位,并验证其是否能够诱导细胞坏死;利用VIGS技术瞬时沉默TaCTSB,解析其对小麦与条锈菌互作的影响。结果表明,TaCTSB基因编码344个氨基酸,N端含有1~19 aa的信号肽,无跨膜结构;qRT-PCR结果显示,TaCTSB基因在小麦与条锈菌非亲和互作早期上调表达。瞬时表达分析发现,烟草叶片上瞬时表达TaCTSB基因能够诱导细胞坏死,且质壁分离后TaCTSB分泌到细胞外。在TaCTSB瞬时沉默植株上接种条锈菌毒性小种CYR31,产孢量变化不显著;而接种条锈菌无毒性小种CYR23,产孢量升高;组织细胞学观察发现,在小麦叶片中瞬时沉默TaCTSB,其活性氧面积和坏死面积显著下降,菌丝面积及菌丝长度均有所增加,表明沉默TaCTSB减弱了小麦对条锈菌的抗性。

小麦条锈菌效应蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能分析

为明确小麦条锈菌吸器特异表达效应蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能,利用PCR获得Hasp58的全长cDNA序列;借助生物信息学软件预测Hasp58的信号肽;将Hasp58构建到pGR106载体用于农杆菌(Agrobactrium tumefacien)介导的烟草瞬时表达系统,明确Hasp58抑制细胞坏死的毒性功能;将Hasp58构建到pCambia1302载体用于烟草细胞定位,明确Hasp58定位情况;将Hasp58构建到pEDV6载体用于荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)介导的小麦瞬时表达系统,对小麦胼胝质、过敏性坏死面积、活性氧、菌丝面积、菌丝长度进行统计分析,明确Hasp58抑制寄主植物PAMPs引发的免疫反应(PTI)和效应蛋白诱导的免疫反应(ETI)功能。结果表明,条锈菌Hasp58的cDNA全长为1 026 bp,编码342个氨基酸,N端含26_aa的信号肽;通过农杆菌侵染,在烟草中瞬时表达Hasp58,发现其能够抑制由BAX诱导的细胞坏死,为条锈菌的候选效应蛋白;烟草细胞定位发现,含有信号肽和缺失信号肽的Hasp58与GFP融合表达均定位在细胞质,推测该效应蛋白在胞质作用;利用细菌的三型分泌系统在小麦中瞬时表达Hasp58,发现其能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧减少,使菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应蛋白Hasp58可抑制寄主植物的PAMPs引发的免疫反应(PTI)和效应蛋白诱导的免疫反应(ETI),并促进自身侵染。

小麦凝集素类受体激酶TaLecRLK1的鉴定及抗锈病功能分析

凝集素类受体激酶(lectin receptor-like kinase, LecRLKs)是一类在植物应答多种生物/非生物胁迫中发挥重要作用的类受体激酶。本研究在小麦与条锈菌互作的转录组中筛选到1个在小麦与条锈菌非亲和互作中显著上调表达的LecRLKs基因TaLecRLK1。该基因全长2 292 bp,编码蛋白含有1个胞外信号肽、B-lectin结构域、PAN_AP结构域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。qRT-PCR分析表明:TaLecRLK1在小麦与条锈菌非亲和互作早期诱导表达,在烟草及小麦原生质体中瞬时表达,TaLecRLK1-GFP定位在细胞膜上。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)沉默TaLecRLK1,接种无毒性条锈菌小种CYR23后,沉默叶片表面产生少量夏孢子堆,组织学观察发现沉默植株中条锈菌菌丝长度增长、侵染点附近活性氧积累面积减少;TaPR1、TaPR2、TaPR5的表达受到抑制,TaCAT和TaSOD则被迅速诱导表达。综上所述,TaLecRLK1对小麦抗条锈病起到正调控作用。

植物抗病性与病害绿色防控:主要科学问题及未来研究方向

粮食安全始终是关系我国国民经济发展、社会稳定和国家自立的全局性重大战略问题,而病害一直是作物优质高产的重要制约因素。全球气候和耕作制度变化,导致病害的发生规律发生新变化,危害趋势愈来愈重。通过抗病育种提高农作物对病原物的抗性是实施病害的绿色防控的重要策略。但培育广谱持久抗性的作物品种具有挑战性,一方面需要不断挖掘新的抗病资源、深入研究抗病机理;另一方面需要突破单要素思维,系统认知病原物—寄主—环境三者之间的关系,剖析病害发生发展过程中复杂的分子互作机制。利用基因编辑、标记辅助基因聚合等新技术,将新成果应用于新品种的设计选育和抗病品种的合理布局,结合病害预测预报、生态调控、农业措施等实现病害有效防控,达到病害绿色防控的目的。

小麦条锈菌细胞质效应子Hasp8抑制植物基础免疫

为明确小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici效应子Hasp8的功能,以小麦条锈菌CYR31侵染水源11小麦叶片的cDNA为模板,通过PCR技术扩增获得Hasp8基因的完整编码区序列,采用qRTPCR技术测定Hasp8基因的表达情况,利用农杆菌介导马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)瞬时表达体系在烟草上验证Hasp8基因是否能够抑制由Bax蛋白诱导的细胞坏死,将Hasp8基因构建到pCAMBIA1302载体用于在烟草上瞬时表达Hasp8进行亚细胞定位以明确该效应蛋白的作用空间;并将Hasp8基因构建到p EDV6载体上用于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens介导的瞬时表达系统以明确该效应蛋白是否能够抑制病原相关分子模式引发的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应。结果表明,Hasp8基因编码117个氨基酸,N端含22 aa的信号肽;qRT-PCR结果显示,Hasp8基因在小麦条锈菌CYR31侵染小麦水源11的早期上调表达。烟草瞬时表达Hasp8基因能够抑制由Bax诱导的细胞坏死;烟草上亚细胞定位发现效应子Hasp8定位于细胞质和细胞核;荧光假单胞菌介导的抑制植物免疫试验结果显示效应子Hasp8能够抑制由荧光假单胞菌诱导的胼胝质积累,并且抑制由小麦条锈菌无毒性生理小种CYR23引起的过敏性坏死和活性氧积累,促进病菌的侵染,菌丝面积和菌丝长度增加。