温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。

莪术不同种和居群的ISSR-PCR分析

目的：应用ISSR-PCR标记技术研究不同种及居群莪术的亲缘关系和遗传多样性。方法：对蓬莪术、广西莪术和温郁金共8个居群的37个样本进行ISSR-PCR分析，用POPGEN32软件分析其遗传相似系数及遗传距离，UPGMA方法聚类，构建亲缘关系系统图。结果：5条引物共扩增出65个位点，其中34个位点是多态性位点，多态位点百分率为52．3％。遗传相似系数变化范围0．6864～0．9997。Neig基因多样性（H）指数为n1521，Shannon信息指数（I）为0．2338，莪术种内的遗传多样性低于种间。结论：莪术居群间的遗传变异较大，而居群内部的分化程度很低。不同居群的莪术与种的特性和地理分布有一定相关性，为莪术的品种鉴定及栽培育种提供了分子生物学依据。

温郁金愈伤组织培养及快速繁殖

为了提纯复壮温郁金资源,快速繁殖良种苗木,满足市场供不应求的现状,对温郁金外植体培养及愈伤组织的诱导、继代、分化和再生进行研究。结果表明:莪术外植体在以MS培养基为基本培养基,附加6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L适于丛生芽的诱导与增殖;附加2,4-D2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L适于愈伤组织的诱导;附加2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L适于愈伤组织的继代培养;附加KT 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L适于愈伤组织的分化,生根的最佳培养基为MS+IAA 1.0 mg/L。因此,可以通过组织培养的方式提纯复壮温郁金资源,进行温郁金的快速繁殖。

聚乙二醇化重组人改构白细胞介素11在食蟹猴体内药代动力学检测方法的建立

目的通过建立聚乙二醇（PEG）抗体结合ELISA法检测PEG化重组人改构白细胞介素11（PEG-m IL11）的血药浓度,PEG-m IL11在食蟹猴体内的药代动力学特征、血药浓度与量效关系。方法食蟹猴皮下注射PEG-m IL11后,在不同时间点采集血样,采用PEG抗体结合ELISA法（双抗体夹心免疫法）测定血清中的PEG-m IL11浓度,计算药代动力学参数,并检测不同时间点的血小板计数,探索血药浓度与量效关系。结果方法特异性良好,准确度与精密度均满足要求,线性范围26.34~200 ng/ml,可用于样品检测。PEG-m IL11在食蟹猴体内的消除T_（1/2）为（13.4±2.4）h,T_（max）为（6.7±2.3）h,C_（max）为（2.4±0.5）μg/ml,AUC_（（0-t））值为（77.7±15.6）μg？h/ml,CL为（4.6±0.8）ml/（h·kg）;而且PEG-m IL11血药浓度达峰先于药效达峰,药效明显滞后。结论 PEG抗体结合ELISA法测定PEG-m IL11浓度,方法稳定可靠,可满足药代动力学研究的需要。PEG修饰m IL-11达到了延长其体内代谢的效果,可减少给药次数,提高治疗便利性。

随机扩增多态性DNA标记技术及其在药用植物研究中的应用

随机扩增多态性DNA(RAPD)技术是近年来广泛应用的分子标记技术之一,以PCR反应为基础,其特点是快速简便、易操作、成本较低,DNA需要量少、无需放射性分析,也不会污染等。该文简述了RAPD技术的原理及优缺点以及其在药用植物遗传多样性分析、药材鉴别和DNA指纹图谱的构建、亲缘关系及系统学研究、药材的道地性等方面的应用,并展望了其发展前景。

温郁金RAPD-PCR反应体系建立及条件优化

在提取纯化温郁金DNA的基础上,利用PCR扩增技术,对Mg2+、dNTP、模板DNA、引物、Taq聚合酶等反应条件进行优化,建立温郁金基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。结果表明:最佳条件是总体积为25μL,其中Mg2+(25mM)2μL,Taq聚合酶(5U/μL)0.3μL,引物浓度(20μM)1.0μL,模板DNA(5ng/μL)1.0μL,dNTP(2.5mM)2.0μL,10×PCRbuffer2.5μL;PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性35s,36℃退火1min,72℃复性1.5min,共42个循环;最后72℃延伸10min,该研究得出的体系是温郁金RAPD-PCR的最适宜反应体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带较清晰、稳定等特点,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础。

重组人胸腺素β4生物学活性测定方法的建立

目的:建立适用于重组人胸腺素β4(rhTβ4)体外质量控制的生物学活性测定方法,用于该制品的生物学活性评价。方法:利用ECV304细胞迁移法,摸索细胞密度、玻连蛋白(Vn)浓度、rhTβ4浓度等影响因素,并对试验条件进行优化及方法验证。结果:细胞密度为0.5×104/孔、Vn浓度为12.5μg/mL、rhTβ4浓度为200nmol/L、孵育时间24h和细胞迁移时间4h时,细胞迁移率较高。结论:建立了rhTβ4生物学活性测定方法,该方法专属性强、重复性好、准确性高,可用于rhTβ4生物学活性测定。

荧光素酶报告基因法测定生物制品活性研究进展

生物学活性是反映生物制品药物有效性的关键质量属性,荧光素酶报告基因法利用报告基因的表达量反映药物的生物学活性,具有高效简便的优势,得到药品监管机构的认可。该文综述了荧光素酶报告基因法的技术原理、关键要素、分类及特征,归纳总结了其在生长因子、激素以及抗体等生物药活性测定方面的应用,可为生物药研发领域的科研人员提供参考。

重组人改构白介素11的聚乙二醇修饰工艺优化研究

目的:提高聚乙二醇(PEG)修饰重组人改构白介素11(interleukin 11 mutein,mIL-11)反应中的单位点修饰率。方法:在考察pH、蛋白浓度、PEG与蛋白的配比等单因素对单位点修饰率影响的基础上,采用DoE设计对修饰工艺参数进行优化并建立响应最大化预测模型。结果:在pH 8. 2,mIL-11浓度0. 8 mg·mL-1,mPEG-SC:mIL-11(摩尔比) 5. 5,修饰温度2~8℃,修饰时间1 h的条件下,单位点修饰率最大可达到53%。结论:经3批验证实验,结果与模型预测值相符,方法可行。

重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析。对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果该方法 DNA浓度在0.003~300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68%、71.75%和72.67%,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02%,中间精密度检测的RSD为9.31%,重复性及精密度良好。用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量。结论成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。

观察重组人肝细胞生长因子裸质粒表达产物在人体血液中的含量及其抗原性变化

目的研究血浆中重组人肝细胞生长因子裸质粒（pCK—HGFX7）表达产物肝细胞生长因子（hepatocyteg rowth factor，HGF）含量在体内的变化，以及应用本品后是否发生免疫反应产生HGF抗体。方法选择21例严重下肢缺血性疾病患者（Rutherford分级4—6级），随机分为4mg、8mg、12mg、16mg4个剂量组。将每组剂量等量平分后在试验期第1天及第15天于下肢缺血部位的供血动脉走行和侧支循环可能建立的部位肌内注射给药。采集第1（第1次给药前）、8、15（第2次给药前）、21、59天血浆样本测定HGF含量；采集第1、15、28、59、91天血浆样本测定HGF抗体含量。结果（1）局部肌内注射给药后受试者血浆中HGF含量范围为216～1189．75pg／mL；（2）未检测到受试者血浆中存在HGF抗体，提示外周血中未见HGF抗体生成。结论重组人肝细胞生长因子裸质粒局部肌内注射后，其表达产物HGF在外周血中含量未见明显异常波动，应用本品后人体没有发生免疫反廊。