血清miR-122作为药物肝损伤生物标志物的敏感性和特异性比较

目的比较研究血清微RNA-122(miR-122)作为药物肝损伤生物标志物的敏感性和特异性,为miR-122用于早期药物肝毒性评价提供依据。方法采用对乙酰氨基酚(APAP,1250 mg·kg^(-1),ig)、α-萘异硫氰酸酯(ANIT,150 mg·kg^(-1),ig)、蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCDD,自由摄食)以及四氯化碳(CCI_4,50%,ip)分别制备大鼠肝细胞损伤模型、胆汁淤积模型、脂肪肝模型以及肝纤维化模型,用于评价miR-122作为药物肝损伤生物标志物的敏感性。采用盐酸异丙肾上腺素(IH,2.5 mg·kg^(-1),iv)和庆大霉素(GM,80 mg·kg^(-1),im)分别制备大鼠心肌损伤模型和肾损伤模型,用于评价miR-122作为药物肝损伤生物标志物的特异性于不同时间点采集大鼠血清和肝组织,采用全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性及总胆红素(TBIL)浓度,采用实时定量PCR检测血清miR-122,并采用HE染色对肝组织进行组织病理检查。结果与溶媒对照组相比,肝细胞损伤模型、胆汁淤积模型、脂肪肝模型和肝纤维化模型组血清miR-122明显升高(>2倍)的时间分别为给药后1.5 h,3 h,2周和4周,均早于传统生物标志物GPT,GOT和TBIL[给药后6 h,12 h,3周和6周均未见明显升高(<2倍)],同时其升高幅度(最大升高倍数分别为235.8,202.7,73.8和600.3倍)也高于传统生物标志物GPT,GOT和TBIL(GPT最大升高倍数分别为9.5,3.9,2.5和6.6倍,GOT为6.0,2.4,1.4和3.5倍,TBIL为2.6,2.3,1.2和1.8倍)在心肌损伤模型中,GOT活性明显升高(2.1倍),而血清miR-122无明显改变;在肾损伤模型中,血清miR-122无明显改变。结论血清mi R-122可作为药物肝损伤生物标志物,且与传统肝损伤生物标志物如GPT,GOT和TBIL相比有更高的敏感性和特异性。

微重力对血管及血管内皮细胞的影响

血管系统功能紊乱是微重力诱导立位耐力不良发生的重要因素之一。血管内皮细胞是覆盖在血管内壁上组成血管管腔面的一层单层细胞,是血管壁的重要组成部分,并且在血管功能调控中起到渗透屏障、调节舒缩等重要作用。近年研究发现,微重力可对不同部位的血管系统和血管内皮细胞产生不同的影响,比如可使脑动脉缩血管反应性增加、舒血管反应性下降,颈动脉和腹主动脉缩血管和舒血管反应性下降,肺动脉缩血管反应性下降、舒血管反应性增加,肠系膜动静脉和下肢动脉缩血管反应性下降。另外,微重力可促进大血管来源的内皮细胞生长,但抑制微血管来源的内皮细胞的生长。本文就微重力对血管及血管内皮细胞影响的研究进展作一概述。

非糖尿病患者脂联素基因SNP+276G/T单核苷酸多态性与冠心病的相关性研究

目的:探讨在中国南京地区汉族人群中脂联素单核苷酸多态性SNP+276G/T与冠心病的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,分析了266例非糖尿病患者的冠脉造影结果和脂联素单核苷酸多态性(SNP+276G/T)的关系,研究设立了病例组和正常对照组。结果:相对于T/T基因型,G/G基因型修正后的OR值为3.16,(P<0.05);G/G+G/T基因型的修正后OR值为2.69,(P<0.05)。结论:脂联素SNP+276G/T各种基因型和冠心病的发病密切相关,G/G基因型很可能是冠心病的易感基因型。

埃他卡林对ET-1诱导的人肺动脉平滑肌细胞KATP通道蛋白表达的影响

目的:研究新型ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂埃他卡林对内皮素-1(ET-1)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)上KATP蛋白表达的影响。方法:原代培养人肺动脉平滑肌细胞,随机分成对照组,ET-1组,ET-1+埃他卡林组,ET-1+吡那地尔组,ET-1+埃他卡林+格列本脲组,ET-1+吡那地尔+格列本脲组,用Western-blot方法分析各组KATP蛋白磺酰脲受体亚单位(SUR2B)和内向整流性孔区亚单位(Kir6.1)表达变化情况。结果:与ET-1的作用相反,埃他卡林能使ET-1诱导下的SUR2B亚基表达升高,特异性KATP阻断剂格列本脲可逆转埃他卡林引起的SUR2B亚基表达升高;但各组对Kir6.1亚基表达无明显影响。结论:埃他卡林通过上调KATP的SUR2B亚基表达而发挥其在治疗低氧性肺动脉高压(HPH)中的作用,可望成为治疗低氧性肺动脉高压的新药。

血管内皮素转换酶－1b C－338A基因多态性与冠心病相关性研究

近年来对内皮素－1（ET－1）研究表明，ET-1能提高血管平滑肌的有丝分裂和增殖，在动脉硬化进程中起了重要作用。血管内皮素转换酶－1b（ECE－1b）C-338A基因多态性的位点位于ECE-1基因启动子（翻译起始点上游338bp）已经明确，且A等位基因比C等位基因有更强的转录活性^[2]。本研究旨在此基础上，探讨ECE—1b C-338A基因多态性与国人冠心病发病危险性的关系。

氯胺酮对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的评价氯胺酮的线粒体毒性,从而探讨氯胺酮可能的毒性机制。方法 Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定10~2000μmol·L-1培养7 d,或加入氯胺酮50~3000μmol·L-1培养24 h,CCK8细胞计数法测定细胞存活率。Hep G2细胞培养基中分别加入齐多夫定100μmol·L-1培养7 d后,或加入氯胺酮100和1200μmol·L-1培养24 h,化学发光法检测胞内ATP合成水平,荧光探针法检测胞内钙离子浓度、活性氧及线粒体膜电位（ΔΨm）的变化,同时设齐多夫定1000μmol·L-1用于实时荧光定量PCR检测线粒体DNA（mt DNA）表达水平的变化。结果与正常对照组相比,齐多夫定10~2000μmol·L-1可以抑制细胞存活,IC50为100μmol·L-1;氯胺酮1000~3000μmol·L-1抑制细胞存活,IC50为1200μmol·L-1。与正常对照组相比,齐多夫定100μmol·L-1组线粒体ATP合成水平显著下降（P〈0.05）,胞内钙离子浓度明显升高（P〈0.05）,活性氧水平显著升高（P〈0.05）,ΔΨm显著下降（P〈0.05）,而1000μmol·L-1可以明显干扰mt DNA表达水平（P〈0.05）。氯胺酮100μmol·L-1组ATP合成水平明显下降（P〈0.05）,其他指标均无显著性差异;氯胺酮1200μmol·L-1组ATP合成水平显著下降（P〈0.01）,活性氧水平和胞内钙离子浓度显著升高（P〈0.01）,ΔΨm显著下降（P〈0.05）,mt DNA水平无明显改变。结论氯胺酮可以通过干扰线粒体代谢功能而诱导线粒体损伤。

体外评价口服降糖药对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的 ：评价DPP-Ⅳ抑制剂类口服降糖药A化合物的线粒体毒性,从而探讨A化合物的可能毒性机制。方法 ：Hep G2细胞培养基中分别加入曲格列酮50-300μmol/L,培养24 h,或加入A化合物溶液100-300μmol/L,培养24 h,CCK8细胞计数法测定细胞存活率。Hep G2细胞培养基中分别加入曲格列酮100、200和225μmol/L培养24 h,或加入A化合物溶液100、150和200μmol/L培养24 h,化学发光法检测胞内ATP合成水平,荧光探针法检测胞内钙离子浓度、活性氧、线粒体膜电位（△Ψm）变化,透射电镜观察线粒体超微结构。结果：与溶媒对照组相比,曲格列酮50-300μmol/L可以抑制细胞存活率,IC50为178μmol/L;A化合物100-300μmol/L对细胞存活率有抑制作用,IC50为159μmol/L。与溶媒对照组相比,曲格列酮≥200μmol/L时导致线粒体ATP显著下降（P〈0.01）、△Ψm显著性下降（P〈0.01）,≥100μmol/L时可致活性氧水平和钙离子浓度显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。A化合物≥100μmol/L时ATP合成水平显著降低、钙离子浓度显著升高（P〈0.01）,≥150μmol/L时活性氧水平明显升高（P〈0.01）,≥200μmol/L时△Ψm显著性下降（P〈0.05）,并可导致线粒体结构发生病变。结论：DPP-Ⅳ抑制剂类口服降糖药A化合物可以通过干扰线粒体代谢功能和结构而诱导线粒体损伤。

新冠疫情对药物非临床研究试验机构的合规性影响及应对策略

目的:探讨如何提升GLP试验机构应对新冠疫情所带来挑战的管理能力。方法:梳理中国、美国、OECD、英国的GLP监管政策,结合本机构2022年上海疫情实际经历,归纳GLP试验机构降低GLP遵从性的风险管控方法。结果与结论:GLP试验机构应着重预案能力的建设(如业务可持续性计划、灾难恢复计划),并从加强自身质量体系建设(如及时优化或新增标准操作规范)、强化技术人员培训等方面提升GLP试验机构管理水平,才能应对各类社会重大突发事件(如新冠疫情)和满足国内外监管机构的要求。

雷公藤多甙对Beagle犬心脏毒性初探

目的探讨Beagle犬在雷公藤多甙急性中毒时对心血管系统的影响。方法 Beagle犬3只,分别间隔48 h灌服雷公藤多甙60和120 mg/kg,给药后采用遥测系统连续监测心电图和血压,并于每次给药后不同时间点检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和心肌钙蛋白T/I(Tn T/I),死亡动物行心脏组织病理学检查。结果 Beagle犬雷公藤多甙急性中毒后心电图出现鱼钩样ST段或T波明显压低,并且血压下降,AST、CK、LDH和TnT水平升高。1只动物死亡,组织病理学检查见其心内膜下出血和多灶性心肌细胞坏死。结论心肌细胞损伤为Beagle犬在雷公藤多甙急性中毒时的主要表现。

新药非临床安全药理学研究进展

安全药理学是新药非临床研究的重要组成部分,主要是研究药物剂量≥治疗剂量时,潜在的不期望出现的对生理功能的不良影响。近年来,随着分子生物学和生物技术等的进步,安全药理学的研究内容和研究范围有了较大的拓展。本文从国际国内安全药理学指导原则要求和修订,到中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统安全药理及补充安全药理(胃肠道系统、泌尿系统、血液系统和肝胆系统)等方面,全面综述了新药非临床安全药理学研究进展。

绿原酸和双黄连粉针剂致敏性比较评价

目的:比较评价绿原酸和双黄连粉针剂的潜在致敏性,并初步探索可疑致敏原绿原酸的致敏机制。方法:绿原酸与含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂同时进行BN大鼠全身主动致敏实验(ASA),激发前取血测定抗体(IgE、IgG、IgA、IgM)、补体(C3、C4)、淋巴细胞免疫表型(CD3/4/8),记录激发后症状;单次静脉给予绿原酸与含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂,测定给药前,给药后5、10、30、60、120、240min血浆中绿原酸浓度。结果:比较ASA激发后过敏反应发生率和发生程度,可知绿原酸过敏反应程度低于含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂;绿原酸组和双黄连组抗体(IgE、IgG、IgA、IgM)、补体(C3、C4)各有不同程度升高,淋巴细胞免疫表型也有一定变化;单次静脉给药测定绿原酸血药浓度,给药后5、10、30、60min时,绿原酸组血浆中绿原酸浓度显著低于双黄连粉针剂组。结论:绿原酸对BN大鼠致敏性低于含等剂量绿原酸的双黄连粉针剂,原因可能是单体和复方绿原酸的代谢差异,也可能是因为绿原酸并非唯一致敏原。

药物肝损伤的潜在生物标志物循环miR-122的研究进展

药物诱导的肝损伤是药物研发失败或退市的主要原因之一,而传统的肝损伤评价指标因为种种缺陷如缺乏特异性或灵敏性而不能为药物的肝毒性评价提供早期、及时和可靠的信号。循环微RNA-122(miR-122)因其在肝脏特异性表达、以及其高度的稳定性和灵敏性成为目前肝毒性评价指标的研究热点。本综述主要从特异性、稳定性和灵敏性3方面系统地阐述循环miR-122成为肝毒性生物标志物的应用潜力,并对下一步的研究工作进行探讨。

对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤大鼠血浆miR-122表达的变化

目的探讨血浆微RNA(miR)-122在药物性肝损伤中的变化及其在肝毒理临床前评价中的作用。方法 SD雄性大鼠单次ig给予对乙酰氨基酚0,625和1250mg·kg-1,并于给药后1.5,3,6,12,24,36及96h采集血样。以乙酰氨基酚诱导急性肝损伤大鼠血浆中稳定表达的miR-103为校正基因,实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)法检测不同时间点大鼠血浆miR-122的表达。测定血浆中不同时间点谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)和肝组织病理学检查。结果组织病理学观察结果显示,与正常对照组相比,大鼠分别ig给予对乙酰氨基酚625mg·kg-1 1.5和3h后,肝组织病理无明显变化,给药后6和12h,肝腺泡Ⅲ带出现明显的空泡样变性和肝窦充血,给药后24h肝腺泡Ⅲ带有明显的细胞坏死;而36h时基本恢复正常;而对乙酰氨基酚1250mg·kg-1组给药后24和36h时肝腺泡Ⅲ带有明显的细胞坏死。与正常对照组相比,大鼠分别ig给予对乙酰氨基酚625和1250mg·kg-1后12和24h,血清GPT和GOT均有显著性升高(P<0.05),且对乙酰氨基酚1250mg·kg-1组大鼠血清GPT活性均是对照组2倍以上。与正常对照组相比,血浆miR-122在大鼠给予对乙酰氨基酚1250mg·kg-1 1.5h即升高3.6倍(P<0.05),并且持续升高,12h达峰值后开始下降,96h恢复正常水平;大鼠给予625mg·kg-1对乙酰氨基酚给药后6h,血浆miR-122升高5.2倍,12h达峰值后开始下降,36h恢复正常水平。肝损伤大鼠血浆miR-122不同时间点的表达水平与肝损伤GPT和GOT变化相似。结论循环miR-122可能成为药物性肝损伤临床前和临床早期检测的理想的血液学分子标志物。

毒理学研究的高内涵筛选及其在药物肝毒性研究中的应用

药物性肝损伤(DILI)是导致药物研发终止或从市场撤回的重要原因之一,建立可预测、高通量的临床前检测系统以评估临床潜在的肝毒性是药物研发的迫切需要。基于细胞成像的高内涵筛选(HCS)技术,允许同时检测多个细胞参数,通过实时监测多种信号通路阐明细胞损伤的机制,具有高度的敏感性和特异性。目前已有多种肝细胞模型用于高内涵毒性筛选。本文介绍了HCS技术,回顾了近年来利用高内涵成像技术获得的药物肝毒性资料,探讨了其在肝毒性机制探索中的应用,以及高内涵成像技术在DILI研究中的作用。

体外评价药物性肝损伤检测终点研究及其在检测系统中的应用

药物性肝损伤(DILI)是临床上导致急性肝衰竭的重要原因。众多新建细胞模型和高通量筛选技术正在被广泛应用于肝毒性筛选评价。在应用这些新技术和新方法之前,重要的是确定哪些毒性终点应被纳入评价体系,以提高对DILI的预测能力。本文结合DILI相关的重要作用机制,介绍了体外肝毒性评价应考虑的检测终点,包括肝细胞毒性、线粒体毒性、胆汁淤积、反应性代谢物导致的肝损伤以及免疫反应相关的肝损伤等,并归纳了这些毒性终点在DILI检测系统中的应用及在应用过程中面临的挑战,以期为新药开发早期的体外肝毒性筛选评价提供参考。

人诱导多能干细胞在药物肝损伤研究中的应用

人诱导多能干细胞具有自我更新和分化的多潜能性,其诱导分化的肝样细胞可应用于药物发现、筛选以及药物肝毒性评价研究。药物性肝损伤是导致上市药物被召回和药物研发失败的主要原因之一。临床前动物实验因其种属差异等方面的不足导致药物临床研究失败,浪费了大量人力物力。本文全面总结了人诱导多能干细胞诱导分化的肝细胞在药物肝毒性评价中的研究应用,希望有助于在药物研发过程中准确把握肝毒性,保证人体用药安全。

血浆/血清MicroRNAs定量分析的校正策略

血液循环microRNAs表达量的变化与各种疾病及组织损伤的相关性研究备受关注。但细胞的污染,RNA提取和处理过程中的试验误差都会不同程度的影响microRNAs定量分析的结果。各种校正策略的使用可以消除这些影响因素。就目前使用的不同校正策略的优缺点进行分析,便于研究者正确选择血液循环microRNAs定量分析的校正方法,从而获得准确可靠的生物学意义上的变化。

血浆外泌体lncRNA在庆大霉素致大鼠肾损伤中的作用

药物诱导的肾毒性(DIN)是药物开发阶段常见的不良反应。传统的肾损伤血清生物标志物,如血尿素氮和血清肌酐,缺乏敏感性和特异性,需要找到更优秀的新型生物标志物。该研究通过对SD大鼠肌内注射80 mg/kg硫酸庆大霉素(GEN)构建药物性肾损伤模型并对其进行全转录组测序,整合DIN血浆外泌体长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA的表达谱。随后,通过实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)测定鉴定并验证差异表达(differentially expressed,DE)的lncRNA,利用基因本体(GO)和京都基因组百科全书(KEGG)富集分析DE mRNA的功能作用,并构建竞争性内源性RNAs(ceRNAs)共表达和调控网络。测序得到了500个DE lncRNA和1027个DE mRNA。经GO、KEGG分析,后者主要与信号转导和免疫系统有关。所构建的ceRNA网络包括32个上调的lncRNAs、151个下调的miRNAs和42个上调的mRNAs。RT-qPCR结果显示NONRATT021116.2和NONRATT004088.2在大鼠血液中确实呈显著上调趋势。针对以上2个lncRNA构建的lncRNA/miRNA/mRNA ceRNA网络中,let-7b-5p表现出与NONRATT021116.2的高度关联,表明它可能参与了GEN致药物性肾损伤中炎症反应的调节。该研究利用测序技术揭示了GEN诱发肾毒性大鼠中的DE lncRNA和DE mRNA,并对这些lncRNAs进行了进一步研究,有助于深入了解DIN的发病机制,有可能找到DIN诊断标志物和治疗靶点。

药物超敏反应安全评价体外替代方法的研究进展

超敏反应是药物的严重不良反应之一,严重时可危及患者生命。目前超敏反应(Ⅰ,Ⅳ型)临床前评价方法多为整体动物实验方法,基于动物福利和3R原则的考虑,以及体外替代方法的迅速发展,目前已建立了数种药物致敏性评价的体外替代方法,包括根据肥大细胞和嗜碱性粒细胞在Ⅰ型超敏反应中发挥的关键作用,用实验室易获得的肥大细胞和嗜碱性粒细胞系如RBL-2H3和KU812研究药物的Ⅰ型超敏反应,另外鉴于树突状细胞在Ⅳ型超敏反应中抗原呈递作用,用THP-1细胞构建的h-CLAT试验体系和LC-SA试验体系在皮肤致敏性的评价方面都显示出较好的发展前景。本文综合近年的国内外文献,对超敏反应的体外替代方法进行了综合论述和评估。

体外评价马兜铃酸对HepG2细胞线粒体功能的影响

目的评价马兜铃酸的线粒体毒性,从而探讨马兜铃酸的可能毒性机制。方法 HepG2细胞培养基中分别加入齐多夫定8 000~20 000μmol/L,或加入马兜铃酸25~500μmol/L,均培养24 h,以CCK8细胞计数法测定细胞存活率。同时比较不同浓度齐多夫定（8 000、16 000和20 000μmol/L）和马兜铃酸（25、200和500μmol/L）培养24 h的胞内ATP合成水平和胞内钙离子浓度、活性氧及线粒体膜通透性转换孔（MPTP）变化,透射电镜观察线粒体超微结构。结果齐多夫定8 000~20 000μmol/L可抑制细胞存活,IC50为12 713μmol/L;马兜铃酸25~500μmol/L可抑制细胞存活,IC50为214.6μmol/L。与溶媒对照组（DMEM）相比,齐多夫定≥8 000μmol/L细胞内活性氧水平显著升高（P〈0.01）;≥16 000μmol/L线粒体ATP显著下降（P〈0.01）、钙离子浓度明显升高（P〈0.01）,并可见线粒体结构发生病理改变;20 000μmol/L组MPTP开放水平显著升高（P〈0.01）。与溶媒对照组（DMSO）相比,马兜铃酸≥25μmol/L,ATP合成水平明显下降（P〈0.01）、MPTP开放水平显著升高（P〈0.01）;≥200μmol/L细胞内钙离子浓度明显升高（P〈0.01）;500μmol/L细胞内活性氧水平显著升高（P〈0.01）、并可见线粒体结构发生病变。结论马兜铃酸可以通过干扰破坏线粒体代谢功能和结构而诱导线粒体损伤。