小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并进行验证,以进一步应用于疫苗免疫效果评价。方法根据幽门螺杆菌尿素酶B亚基（urease B,Ure B）在各菌株中相对保守的特性设计引物,优化其扩增条件,建立幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并对方法的专属性、精密性、准确性及检测限进行验证。结果所设计的引物在阳性样本中可特异性地扩增出目的基因片段,且小鼠胃部中其他菌体的存在不影响反应结果的特异性。标准品质粒DNA模板含量在1×10^7-1×10^2拷贝/μl范围内线性良好,相关系数r^2大于0.995,扩增效率在90%-110%之间。应用于小鼠胃组织幽门螺杆菌检测,具有较好的准确性和精密性,回收率为96.25%-101.42%,试验内和试验间相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均小于6%。用该方法检测高、中、低浓度的Hp菌液、并模拟定量Hp菌株在小鼠胃组织中的状态,试验内及试验间RSD均小于6%,精密度良好。其回收率大于80%,与平皿计数法一样,但灵敏度显著高于平皿计数法。结论 SYBR GreenⅡ实时定量PCR法快速有效,专属性良好,线性范围广,可重复性好,使用方便,可用于定量检测幽门螺杆菌在小鼠胃部组织中的定植,从而进一步应用于评估免疫反应对细菌定植的影响。

金黄地鼠作为狂犬病暴露后疫苗免疫动物模型的应用

目的以金黄地鼠作为动物模型,评价不同种类狂犬病疫苗在暴露后免疫中的保护效果。方法将不同类型狂犬病疫苗分别免疫两组金黄地鼠,一组为未感染过病毒的健康动物(Pr EP),另一组为感染过CVS株的动物(PEP),免疫后不同时间点通过心脏穿刺采血,RFFIT法测定血清抗体效价。对PEP组动物同时观察其死亡情况,分析各动物抗体水平与保护效果的相关性。另以4.0 lg MICLD_(50)/ml的CVS狂犬病固定毒株感染金黄地鼠左腿腓肠肌,每只0.2 ml,6 h后开始以不同类型狂犬病疫苗按0、3、7、14 d程序免疫,观察疫苗对动物的保护效果。结果暴露后免疫组(PEP)的血清抗体可在第4天出现阳性,第5天达100%,以后持续维持较高水平。未感染的暴露前免疫(Pr EP)动物的抗体水平从第4天开始一直较PEP组低。但PEP组中不同疫苗免疫的各动物中均观察到免疫后第4天及以后的抗体水平与最终该动物的发病死亡无相关性。高效价人用狂犬病疫苗的免疫保护率为80%,但疫苗原液分别稀释2倍和5倍后,保护率分别降至30%和20%。疫苗加PIKA佐剂作相同倍数稀释后,保护率可达80%,疫苗联合使用免疫球蛋白,暴露后保护率可达100%,未免疫的感染对照组动物的死亡率在90%左右。结论以金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫的动物模型可对不同质量疫苗作出有效评价。疫苗的效价与暴露后免疫中的保护作用有相关性,疫苗联合使用免疫球蛋白注射是最佳的暴露后免疫方案;PIKA佐剂在降低疫苗抗原量的同时提高了疫苗的保护作用;暴露后抗体水平未显示与保护效果具有相关性。

狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究

目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位（plaque-forming unit,PFU）和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度（CCID50）,并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法（direct immunofluorescent assay,dFA）做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 （PFU和CCID50）测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。

叙利亚地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的研究

目的对叙利亚地鼠（地鼠）作为狂犬病暴露后疫苗免疫效果动物模型的可行性进行研究。方法将狂犬病病毒CVS株和CTN-1V株分别肌内感染不同周龄的地鼠和小鼠，观察动物对不同毒株的敏感性。用直接免疫荧光法检测CVS株进入地鼠脑组织的情况；用快速荧光灶抑制试验检测血清中和抗体。以不同病毒量CVS株感染8周龄雌性地鼠，确定暴露时病毒的最佳感染剂量。对暴露后地鼠用疫苗进行免疫，观察疫苗的保护效果。结果地鼠感染后7d左右出现狂犬病临床症状，同一病毒株对地鼠的致病力比小鼠强[6．4～8．0 lg半数致死量（LD50）／ml对3．4～6．5 lgLD50／ml]；3周龄和8周龄地鼠对病毒的敏感性无差异。感染后5～6d病毒进入地鼠脑组织。以3．8～4．0 lg小鼠脑内半数致死量（MICLD50）／ml的CVS株感染后6～7d，地鼠血清中检出中和抗体。暴露后疫苗免疫结果显示，不同疫苗具有不同程度的保护效果。结论地鼠对狂犬病病毒神经外途径感染敏感，临床症状典型，潜伏期恒定，感染后免疫血清抗体应答出现早，具备作为暴露后疫苗免疫动物模型的条件。

cGAMP可显著增强针对诺如病毒（GⅡ.4）病毒样颗粒抗原的体液免疫应答

目的 评价环二核苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate, cGAMP）在诺如病毒（GⅡ.4） 病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）疫苗研发中作为佐剂的免疫增强效应.方法 将cGAMP和铝盐佐剂（氢氧化铝）分别与不同剂量诺如病毒（GⅡ.4）VLPs抗原配伍,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过测定免疫血清中抗VLPs特异性IgG抗体及其亚型,检测阳性血清中模拟中和抗体水平,比较两种佐剂对VLPs抗原免疫效果的促进作用.结果 以cGAMP为佐剂,VLPs可诱导较高的血清特异性IgG抗体应答;用相同剂量VLPs抗原免疫,配伍cGAMP佐剂诱导的IgG抗体应答水平明显高于铝佐剂,cGAMP配伍低剂量VLPs加强免疫后诱导的IgG抗体水平与铝佐剂配伍高剂量VLPs相当,模拟中和抗体水平与血清IgG水平相对应.结论 cGAMP可显著增强针对诺如病毒（GⅡ.4）VLPs的特异性体液免疫应答,其佐剂活性高于传统铝佐剂,是一种有望应用于疫苗研发的新型佐剂.

幽门螺杆菌在BALB/c小鼠中的定植及初步评价

目的 建立长期、稳定定植于小鼠胃部的幽门螺杆菌动物模型,并进行免疫反应检测分析。方法 用灌胃针灌喂小鼠幽门螺杆菌3次后,定期处死并进行胃组织幽门螺杆菌培养试验、PCR鉴定、组织切片染色、快速尿素酶试验、胃组织病理学检查、血清抗幽门螺杆菌抗体检测及细胞免疫分析。结果 6周龄小鼠观察至32周,3周龄小鼠观察至12周时,幽门螺杆菌定植量均稳定在约104个CFU/g胃组织;诱导产生的血清抗幽门螺杆菌IgG抗体水平均在10周时到达峰值,并一直维持较高水平;粪便中均未检测到特异性sIgA抗体;3周龄小鼠感染幽门螺杆菌2周时的流式细胞术检测结果显示,肠道上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes,IELs)IL-17和IFNγ反应较未感染对照组小鼠均有降低趋势;胃组织切片染色分析显示,定植小鼠从感染后第6周胃部开始出现病理变化。结论 获得了幽门螺杆菌在BALB/c小鼠中的长期稳定定植模型,观察到组织病理变化和显著的血清IgG抗体反应,粪便中未观察到特异性sIgA反应,3周龄小鼠观察到Th1及Th17反应有降低趋势,为治疗性疫苗候选抗原的评价奠定了基础。

BALB/c小鼠口服幽门螺杆菌裂解物配伍dmLT佐剂诱导黏膜局部及系统性免疫应答

目的观察口服免疫幽门螺杆菌(Hp)裂解物配伍黏膜佐剂双突变大肠埃希菌热不稳定毒素(double mutant heat-labile toxin,dmLT)在BALB/c小鼠中诱导抗Hp免疫保护效果,分析相关免疫应答特点。方法将SS1(Sydney strain 1)株Hp裂解物配伍佐剂dmLT经口服免疫BALB/c小鼠后,进行幽门螺杆菌胃部活菌接种。对照组小鼠给予口服生理盐水,每只200μl。感染后6周检测幽门螺杆菌胃部定植量,采集血清、脾脏、肠系膜淋巴结、小肠、盲肠、粪便等样本进行相关免疫应答分析。结果抗原配伍佐剂免疫组小鼠与对照组相比较胃部幽门螺杆菌定植量降低;血清中检测到比对照组更强的特异性IgG抗体反应,IgG亚型主要以IgG1为主,且IgG1/IgG2a比值显著高于对照组;小肠、盲肠、粪便中均检测到较高的sIgA,小肠中最为显著,而对照组中均未有明显sIgA反应;脾和肠系膜淋巴结中IL-17+CD4+T比例与对照组相比较显著升高。结论口服免疫Hp裂解物配伍佐剂dmLT诱导黏膜局部及系统性免疫应答,增强BALB/c小鼠抗幽门螺杆菌感染,与显著增强的Th17免疫应答,以及Th细胞中Th2的极化相关,该结果为进一步评价dmLT作为黏膜佐剂用于幽门螺杆菌重组蛋白疫苗提供了实验资料。

cGAMP可显著增强BALB/c小鼠对幽门螺杆菌蛋白抗原的免疫应答

目的评价环鸟-腺二核苷酸(cGAMP)在非口服幽门螺杆菌蛋白类疫苗研发中作为佐剂的免疫增强效果。方法以cGAMP为佐剂,与幽门螺杆菌蛋白抗原,包括UreA、UreB和NapA混合,通过皮下途径注射免疫BLAB/c小鼠,同时设置单独抗原组和佐剂组对照,以间接ELISA法测定免疫前后血清中抗原特异性IgG抗体和盲肠灌洗液中IgA抗体;流式细胞术分析脾及腹腔淋巴结(MLN)中T淋巴细胞IFN-γ分泌水平;酶联免疫斑点(ELISpot)分析脾淋巴细胞中抗原特异性IFN-γ的分泌水平。结果cGAMP可促进小鼠抗幽门螺杆菌蛋白抗原的特异性IgG抗体应答;流式细胞术及ELISpot技术检测结果显示cGAMP可促进淋巴细胞抗原特异性IFN-γ的分泌。结论cGAMP作为一种稳定的小分子化合物佐剂,通过皮下免疫途径,虽然不能诱导较强的黏膜sIgA抗体反应,但是可诱导较强的特异性T淋巴细胞反应和血清特异性IgG抗体应答,显著减少疫苗中抗原用量,为非口服幽门螺杆菌疫苗研发提供了一种新思路。

cGAMP与幽门螺杆菌蛋白抗原肌肉注射诱导BALB/c小鼠免疫应答初步分析

目的初步分析肌肉注射免疫环鸟-腺二核苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP)与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)蛋白抗原在BLAB/c小鼠中诱导的免疫应答。方法将BALB/c小鼠随机分成4组,cGAMP组、抗原组(H.pylori蛋白抗原)、cGAMP+抗原组及对照组(未免疫),肌肉注射免疫小鼠。间接ELISA法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体、胃组织及粪便上清液中IgA抗体;CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞体外增殖水平;酶联免疫斑点法(ELISpot)分析脾淋巴细胞分泌抗原特异性细胞因子水平。结果经肌肉注射免疫,cGAMP+抗原组可诱导小鼠产生显著高于对照组的血清IgG抗体应答(P<0.01);可诱导胃肠道黏膜产生显著高于单独抗原组的特异性IgA抗体应答(P<0.05);体外孵育H.pylori蛋白抗原和脾淋巴细胞,促进了淋巴细胞的增殖,cGAMP+抗原组显著高于单独抗原组(P<0.01);与单独抗原组及对照组比较,cGAMP+抗原组免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞中抗原特异性IFNγ分泌细胞数量最多(P<0.01)。结论cGAMP通过肌肉注射途径可诱导BLAB/c小鼠对H.pylori蛋白抗原的体液免疫应答及脾脏中抗原特异性淋巴细胞免疫反应,其具有作为肌肉途径免疫H.pylori蛋白疫苗佐剂的潜质。

新型冠状病毒BF.7变异株的分离鉴定与基因序列特征分析

目的分离新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)流行株并进行鉴定,对分离株和传代培养物开展序列特征分析。方法对2022年12月收集的11份SARS-CoV-2抗原初筛呈阳性的鼻咽拭子样本进行病毒分离。实时荧光定量PCR检测SARS-CoV-2核酸,核酸阳性样本接种Vero细胞进行病毒分离,Western blot和间接免疫荧光法检测病毒抗原,透射电镜观察病毒形态。提取病毒分离株及后续传代培养物核酸,对病毒基因组测序并进行序列分析。结果11份样本实时荧光定量PCR检测结果均为SARS-CoV-2阳性。成功分离出7株SARS-CoV-2,其在Vero细胞中可连续稳定传代,滴度可达106.25细胞培养半数感染量(50%cell culture infectious dose,CCID 50)/ml。Western blot和间接免疫荧光结果显示病毒分离株可被SARS-CoV-2单克隆抗体和恢复期血清特异性识别;透射电镜观察到病毒颗粒呈球形,直径约为100 nm;通过二代测序技术成功获得病毒全基因组序列,序列分析结果显示,7株分离株均为SARS-CoV-2,与Wuhan-Hu-1株(NC-045512)序列同源性>99.50%,7株分离株之间序列同源性为99.98%,同属于Omicron BF.7进化分支。对BJ-NVSI-20230005分离株连续传代和蚀斑纯化后进行序列分析,结果显示4~6与1~3代病毒相比,ORF1ab基因和E基因分别有1个核苷酸位点发生突变和3个核苷酸的缺失,其中ORF1ab基因C→T突变导致亮氨酸变为苯丙氨酸;E基因3个核苷酸缺失导致缬氨酸缺失。蚀斑纯化克隆序列存在多态性。结论成功分离的7株SARS-CoV-2流行毒株均为BF.7进化分支,与中国内地2022年12月流行趋势一致。