固原黄牛不同部位肌肉组织代谢组学分析

旨在探究与固原黄牛肉风味形成相关的关键代谢物、代谢途径和酶,为深入解析固原黄牛肉肉品组成提高肉品质量奠定基础。本研究选用同一生长条件下,24月龄的6头健康雄性固原黄牛作为研究对象,利用非靶向代谢组学技术对眼肉、肩肉和臀肉3个组进行代谢物分析鉴定,通过主成分分析、偏最小二乘法判别分析和聚类分析筛选差异代谢物,并对筛选结果进行富集分析。随后,利用FELLA分析调控不饱和脂肪酸合成代谢相关的途径以及潜在的关键代谢物,同时对差异代谢物进行WGCNA分析。代谢物分析结果显示,固原黄牛眼肉、肩肉和臀肉3个组共鉴定出689个代谢物,其中脂质和类脂分子占比32.08%,脂肪酸类代谢物49种,聚类分析肩肉组和臀肉组样本聚为一类,眼肉组样本单独为一类。N6,N6,N6-三甲基-L-赖氨酸(N6,N6,N6-trimethyl-L-lysine)和麦芽三糖(maltotriose)是眼肉、肩肉和臀肉组与组之间共同的差异代谢物,二者含量均在眼肉最高。KEGG通路分析显示,差异代谢物主要富集在不饱和脂肪酸生物合成、嘌呤代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路。通过WGCNA分析筛选出与3个肌肉部位相关的模块,并鉴定出了各模块中的关键代谢物。本研究通过对固原黄牛不同部位肌肉组织进行代谢组学分析,鉴定到与肉品质差异和风味形成相关的10种关键代谢物和17种关键酶,为今后探究固原黄牛肉风味形成的分子调控机制和分子育种提供理论基础,同时也为其他肉牛的品质性状育种提供参考。

circADAMTS16的表达谱分析及其对牛脂肪细胞分化的影响

旨在探究 circADAMTS16在牛不同组织和前体脂肪细胞中的表达水平及其对牛脂肪细胞分化的影响,为进一步研究circRNA在细胞分化和脂肪组织发育过程中的调控作用提供依据。采用组织块法分离培养牛原代前体脂肪细胞并诱导分化,模拟牛脂肪组织生长发育过程;通过qRT-PCR检测 circADAMTS16在牛不同组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪)和脂肪细胞分化不同阶段(0 d、2 d、4 d、8 d、10 d)的表达水平;构建 circADAMTS16的过表达载体(pCD2.1- circADAMTS16),设计合成 circADAMTS16的小干扰RNA (si- circADAMTS16),采用(Lipofectamine3000)转染试剂将pCD2.1- circADAMTS16和si- circADAMTS16转染牛前体脂肪细胞,利用qRT-PCR法检测转染效果,同时检测脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ的表达量变化,并进行油红O染色,综合分析干扰和过表达 circADAMTS16对牛脂肪细胞分化的影响。结果如下:(1)qRT-PCR检测结果表明 circADAMTS16在心脏中表达量最高,肝脏次之,脾最低;(2)在牛原代前体脂肪细胞分化过程中, circADAMTS16在第2天显著高表达,随后逐渐降低,在第8天时达到最低。(3)在牛前体脂肪细胞中过表达 circADAMTST16后,脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表达量显著下降;油红O染色结果显示,过表达后脂滴形成数量明显少于对照组;而干扰 circADAMTS16表达后,脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPα表达量显著上升。综上所述, circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞的分化过程具有显著的调控作用,过表达 circADAMTST16可抑制牛原代前体脂肪细胞分化进程,而干扰 circADAMTS16表达可以促进牛原代前体脂肪细胞分化进程,探明 circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞分化的具体调控作用。

固原黄牛遗传背景及其体尺指数、肉用指数分析

旨在鉴定固原黄牛是相对独立的肉牛遗传资源,进一步描述其生长发育规律,为固原黄牛肉用种质资源的鉴定和选育提供一定的理论依据。本研究通过历史文献和调查研究分析固原黄牛的演变历史;使用GGP Bovine 100K基因芯片检测和公共数据库中下载包括固原黄牛在内共计13个品种、337个个体全基因组遗传变异数据,通过多维标度分析和构建邻接法系统发育树,分析固原黄牛遗传背景;以红安格斯牛×固原黄牛杂交牛为对照群体,测定与收集不同生长发育阶段固原黄牛的体重、体尺、背膘厚和眼肌面积等表型数据,参照《中国畜禽遗传资源志·牛志》公开发表的秦川牛和蒙古牛的表型数据,从表型描述挖掘固原黄牛相关指标的群体规律。结果表明,固原黄牛是固原本土黄牛与周边蒙古牛和秦川牛相互影响,经过长期选育形成的体型外貌一致的独特类群;现存固原黄牛群体在遗传结构上与邻近的秦川牛和晋南牛遗传关系较近,是相对独立的资源群体;与固原黄牛青年母牛相比较,固原黄牛成年母牛体躯指数提升了9.57%;用红安格斯牛杂交改良后,固原黄牛杂交牛母牛胸围指数和体躯指数分别提升了11.59%、12.70%,固原黄牛杂交牛公牛体长指数、胸围指数分别提升了15.15%、19.26%;固原黄牛成年母牛肉用指数为2.65±0.46,固原黄牛成年公牛肉用指数为2.87±0.35,均属役用牛;固原黄牛公牛背膘厚为(5.29±1.41)mm,高于蒙古牛公牛背膘厚(4.00±1.00)mm;固原黄牛公牛眼肌面积为(62.17±8.51)cm^(2),介于秦川牛公牛眼肌面积(79.80±9.70)cm^(2)和蒙古牛公牛眼肌面积之间(50.40±9.80)cm^(2)。固原黄牛是新的肉牛遗传资源,拥有良好的肉用种质特性,但其体尺指数、肉用指数还未达到专用化肉牛标准,后期需要加强选育,并进行良种扩繁和遗传改良,进一步发挥其种质资源特性。

牛EGR2基因转录本X1的CDS区克隆及表达特性分析

【目的】克隆牛EGR2基因转录本X1(EGR2-X1)的CDS区,检测其在不同组织和前体脂肪细胞分化过程中的表达模式并预测其编码蛋白的结构与功能。【方法】采用PCR结合测序技术扩增牛EGR2-X1的CDS区,胶原酶消化法分离牛前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测EGR2-X1在牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背部脂肪组织中的表达规律及前体脂肪细胞分化过程中的时序表达模式,同时利用ProtParam、Phyre2、NetPhos 3.1等软件分析EGR2-X1的理化性质与蛋白结构。【结果】成功克隆牛EGR2-X1的CDS区,其CDS区全长1458 bp,编码由485个氨基酸构成的不稳定且不存在跨膜结构与信号肽的亲水性蛋白,该蛋白含有3个典型的锌指结构域,其氨基酸主要由无规卷曲和延伸链构成,主要在细胞核内发挥作用,同时,蛋白互作网络预测发现,EGR2-X1可能与SOX10、EGR1、EGR3等蛋白存在互作关系。系统进化树分析发现普通牛与水牛亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远,表明EGR2-X1蛋白在物种间保守性较强。组织表达谱分析显示,EGR2-X1在心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背部脂肪组织中均有表达,在肺脏中表达量最高,背部脂肪和肝脏中表达量次之,肾脏中表达量最少。细胞时序表达谱表明,EGR2-X1在第3天表达量最高,此后逐渐下降,至第7天表达量最低。【结论】EGR2-X1在调控牛脂肪细胞的增殖分化和脂质代谢过程中发挥重要功能。

过表达circNMT1促进水牛脂肪细胞的成脂分化

旨在鉴定非编码RNA circNMT1,明确其组织和细胞的表达模式,以及探究过表达circNMT1对脂肪细胞分化的影响。本试验以30月龄中国沼泽水牛(信阳水牛,n=3)的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部皮下脂肪组织和前体脂肪细胞以及3T3-L1细胞为试验材料。通过半定量PCR和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术对circNMT1进行鉴定、细胞定位并明确其时空表达模式。进一步分别将其过表达到3T3-L1和水牛前体脂肪细胞中,利用形态学方法及定量方法检测过表达后脂滴累积情况,同时采用qRT-PCR检测脂肪标志基因相对表达水平的变化。结果表明,circNMT1是真实存在且稳定表达的circRNA,在水牛前体脂肪细胞的细胞核和细胞质中均表达,且在脂肪组织和成熟的脂肪细胞中高表达(P<0.001)。功能获得性试验表明,在3T3-L1细胞和水牛脂肪细胞,circNMT1显著促进脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高成脂标志基因PPARG、C/EBPα和FABP4的相对表达水平(P<0.01)。circNMT1可能是水牛脂肪细胞分化的正调控因子,这为circNMT1在水牛脂肪细胞中的调节作用提供了新见解。

牛PLIN1基因CDS区扩增及时序表达

PLIN1(Perilipin1)基因是调控脂类代谢的“分子开关”,其编码的脂滴包被蛋白是脂滴表面含量最丰富的蛋白,在脂肪沉积中起关键作用。采用RT-PCR方法扩增牛PLIN1基因编码区序列,利用组织块法和消化法分离培养牛前体脂肪细胞,进一步利用qPCR技术检测PLIN1在牛皮下前体脂肪细胞诱导分化过程中(0、2、4、6、10 d)mRNA的相对表达水平。结果表明,牛PLIN1基因CDS区长为1551 bp,共编码517个氨基酸;细胞时序表达结果显示,诱导分化的第0天PLIN1不表达,随着分化时间的推移,其表达量呈上升趋势,与分化的第2天相比,在第6天和第10天表达量上升最快,PPARγ在分化的第0天有少量表达,表达趋势与PLIN1一致,在第6天和第10天显著升高。表明PLIN1在牛脂肪组织生成过程中起重要作用,在前体脂肪细胞分化阶段依赖于PPARγ的表达而表达。

奶牛乳腺炎差异表达lncRNA BCL2对炎症及凋亡相关mRNA表达的影响

本研究旨在探讨长链非编码RNA BCL2(lncRNA BCL2)对奶牛乳腺上皮细胞炎症及凋亡中的调控作用。利用RNAhybrid、Targetscan和miRwalk软件分析lncRNA BCL2海绵吸附的miRNAs及其所靶向的mRNAs,并对这些靶基因进行KEGG通路富集分析;采用qPCR和lncRNA超表达技术研究了lncRNA BCL2在乳腺组织和乳腺上皮细胞炎症中的表达情况及其对乳腺上皮细胞炎症和凋亡相关基因表达的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA BCL2在临床乳腺炎奶牛的乳腺组织和LPS诱导炎症的乳腺上皮细胞中的表达量均显著下调(P<0.05);在lncRNA BCL2超表达的情况下,乳腺上皮细胞内炎症因子IL-1β与IL-8及炎症信号通路关键基因NF-κB(p65/p50)的表达量均显著上调(P<0.05);细胞凋亡相关的CASP3和CASP9基因的表达显著下降(P<0.05),BCL2表达量显著上调(P<0.001),且BCL2与BAX比值大于2。该结果与生物信息学分析结果相符,表明lncRNA BCL2可能通过lncRNA BCL2-miRNA-BCL2-(NLRP1,CASP1,NLRP3)网络调控奶牛乳腺上皮细胞的炎症与凋亡。综上,奶牛乳腺炎过程中,lncRNA BCL2的表达量下调,减弱了其对IL-1β、IL-8和NF-κB表达上调的作用,从而可能缓解了乳腺炎症;同时,lncRNA BCL2表达量下降减弱了其下调CASP3和CASP9基因表达和上调BCL2基因表达的作用,从而可能促进了奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

牛ADIG基因启动子转录调控分析

旨在构建脂肪生成素基因(adipohenin,ADIG)在牛不同组织中的表达谱,鉴定其核心启动子区域及关键转录因子,以期阐明其转录调控的分子机制。本研究采集3头((24±2)月龄)健康南阳公牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪组织,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测各组织中ADIG基因的相对表达量;克隆获得牛ADIG基因上游启动子区2245 bp序列,构建6个pGL3-WT,与pRL-TK共转染293T细胞、原代脂肪细胞和3T3-L1细胞,进一步利用生物信息学预测其核心启动子区的关键转录因子。结果发现,ADIG基因在南阳牛肺(P<0.05)、肾(P<0.05)和皮下脂肪(P<0.05)组织中高表达;克隆得到2245 bp及其6段缺失片段序列的ADIG基因的启动子序列,成功构建了pADIG-1621/+59、pADIG-1288/+59、pADIG-850/+59、pADIG-589/+59、pADIG-321/+59和pADIG-79/+59双荧光素酶报告载体,并检测到牛ADIG基因启动子核心区域在-321/-79;生物信息学初步预测牛ADIG基因核心区域含有C/EBPα、PPARδ、CREB、STAT5和AP-2α等转录因子结合位点。综上,牛ADIG基因在皮下脂肪组织中表达量最高,其启动子核心区位于-321/-79,C/EBPα、PPARδ、CREB、STAT5和AP-2α等转录因子对ADIG基因转录活性具有调控作用。本研究结果为探究ADIG基因在肉牛分子水平上的改良培育提供理论依据。

牛HoxC9基因CDS区克隆及表达谱分析

本研究旨在克隆牛HoxC9基因的CDS区,并分析其生物信息学特征,检测HoxC9在牛7种组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背脂)和原代脂肪细胞分化过程(0~10 d)中的表达规律,采用PCR法获得牛HoxC9基因的CDS区,利用ProtPram、TMpred、ProtFun 2.1 Server等在线网站对HoxC9蛋白进行生物信息学分析,qPCR检测HoxC9在牛不同组织以及原代脂肪细胞分化过程中的表达量。结果表明,牛HoxC9基因CDS区全长783 bp,编码260个氨基酸,是能发生核质转位的亲水性蛋白,其氨基酸序列主要由无规卷曲和α-螺旋构成。HoxC9在牛背脂中的表达量相对其他组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉)较高;随着细胞分化时间的推移,以0 d为对照,HoxC9的表达水平在第4天达到最高(P<0.01),第6天开始逐渐降低,在第8天表达水平达到最低。该研究结果为进一步揭示牛HoxC9基因的功能提供基础资料。

秦川牛CAP2基因CDS区克隆及表达谱分析

[目的]克隆秦川牛CAP2基因的编码区序列(CDS),分析该基因在不同组织及原代脂肪细胞分化过程中的表达特征。[方法]采用RT-PCR方法扩增秦川牛CAP2基因的CDS区,运用ProtPram、TMpred、ProtFun 2.1 Server等在线网站进行CAP2蛋白的生物信息学分析;通过油红O染色和qPCR检测成脂标志基因PPARγ和FABP4基因的表达水平以构建牛原代脂肪细胞诱导分化体系;利用qPCR检测分析CAP2基因在秦川牛7种组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背脂)和原代脂肪细胞分化过程(0~10 d)中的表达。[结果]秦川牛CAP2基因CDS区长1461 bp,编码486个氨基酸,氨基酸序列主要由无规卷曲和α-螺旋构成。CAP2基因在脂肪组织中高表达,极显著(P<0.01)高于其他组织。牛原代脂肪细胞诱导分化过程中,PPARγ和FABP4基因的表达量逐渐上升,与第0天相比第10天时表达量达到最大(P<0.01);与对照组相比,诱导分化组脂滴积累明显增加;CAP2基因表达量也随时间推移逐渐上升,以0 d为对照,第10天表达量最高(P<0.001)。[结论]成功克隆了秦川牛CAP2基因全长1461 bp的编码区;CAP2基因在牛脂肪组织中以较高水平表达,且CAP2基因可能参与脂肪生成与分化过程,预测CAP2基因可能是促进成脂分化的转录因子,对维持牛脂肪细胞状态发挥关键作用,可能作为秦川牛肉质性状的候选基因,该研究结果为进一步揭示牛CAP2基因的功能提供基础资料。

牛miR-504靶基因对奶牛乳房炎调控机制的预测分析

目的预测分析牛miR-504(bta-miR-504)靶基因对奶牛乳房炎的调控机制。方法应用miRBASE数据库检索并分析miR-504成熟序列在不同物种中的保守性,TargetScan及miRWalk软件预测bta-miR-504的靶基因,DAVID在线软件对靶基因进行GO分类统计注释分析和KEGG通路注释分析,STRING在线软件和Cytoscape软件进行蛋白相互作用分析,采用Cytohubba软件中的11种方法计算并分析候选靶基因中的核心基因。结果miR-504成熟区序列在不同物种间呈高度保守。共筛选出477个bta-miR-504候选靶基因,其参与的主要生物过程包括细胞内信号转导、细胞内蛋白转运和负调控MAPK活性等,显著富集于癌症、内吞、Ras、雌激素和胰岛素信号通路。与候选靶基因编码蛋白存在较多互作关系的蛋白包括TOLLIP、RIK3R1、TRAF6、EGFR、FBXL20、FBXL18、FBXO41、FBXL12等,其编码基因参与癌症、催乳激素、雌性激素、胰岛素、NF-kappa B、AMPK、Ras、TNF及心肌细胞肾上腺激素等信号通路。btamiR-504候选靶基因调控网络中的核心基因为TRAF6和CFTR。结论bta-miR-504核心候选靶基因TRAF6和CFTR可能通过AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信号通路参与奶牛乳房炎的调控作用。