绿色出行迎接G20峰会

中国素有“自行车大国”之称,20世纪9 0年代以前,自行车是国民的主要代步工具。随着人民生活水平的提高,自行车的功能也发生了很大的变化,由单一的代步工具逐步成为了低碳生活的“代言人”。近几年,中国政府积极倡导绿色健康的低碳出行方式,中国自行车协会也相应举办了一系列绿色出行主题活动为之助力,推动了我国自行车骑行文化的进一步发展。

基于成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术的高迁移率族蛋白B2基因敲除巨噬细胞Raw264.7细胞株的构建与功能鉴定

目的通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7), 并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA), 将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞, 利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2-/- Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力, 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2-/- Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用t检验。结果利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株, HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达, HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较, 差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15, t=0.17, P>0.05), 但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%, t=5.62, P<0.01];KP感染HMGB2-/- Raw264.7, 促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml, t=5.00, P<0.01;(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml, t=3.36, P<0.01;(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml, t=3.68, P<0.05]。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株, 验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

肺炎克雷伯菌氨基肽酶A的克隆表达与活性鉴定

目的对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达,鉴定其酶活特性。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence:NZ_CP045783.1)设计扩增引物,以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长,使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白,使用N^(2+)层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物,测定KP PepA对其水解能力,并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子,观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用t检验。结果扩增出长度为1527 bp的KP PepA基因,并获得可溶性KP PepA蛋白,大小为56.1×103,与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00)μmol/L比(8.00±2.00)μmol/L,t=63.36,P<0.01],表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37℃,最适pH值为pH 8.0。Co^(2+)、Mn^(2+)均可以提高KP PepA酶活性,其中Co^(2+)激活作用最强,加入Co^(2+)组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00,t=16.44,P<0.01);Zn^(2+)、Fe^(2+)均可以抑制KP PepA酶活性,其中Zn^(2+)抑制作用最强,加入Zn^(2+)组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00,t=8.49,P<0.01)。结论肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

肺炎克雷伯菌外膜蛋白A和黏附素蛋白抗原优势表位融合表达与小鼠免疫保护效果

目的探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列,通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位,经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体,并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,Ni+层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠,同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定,并对小鼠鼻腔注射KP,观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用t检验。结果分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列,并成功融合,融合片段大小为1056 bp,与预测大小一致,克隆至pColdI载体后测序,测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化,获得可溶性rAD,大小为38.4×10^(3),与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后,免疫组抗体滴度显著高于对照组(170667.00±59121.00比0.00±0.00,t=5.00,P<0.01)。KP感染小鼠后,免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%,t=22.52,P<0.01],免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9500.00±1384.00)CFU比(87833.00±25365.00)CFU,t=7.55,P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激,免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21)pg/ml比(24.00±9.17)pg/ml,t=8.14,P<0.01;(200.30±8.51)pg/ml比(9.00±3.00)pg/ml,t=36.75,P<0.01;(92.33±6.11)pg/ml比(9.67±1.53)pg/ml,t=22.73,P<0.01]。结论KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD,免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

肺炎克雷伯菌外膜蛋白A慢病毒载体的构建及其对Raw264.7细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体的激活

目的探究肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)是否可以激活Raw264.7巨噬细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP OmpA基因序列(GenBank Number:AJ000998.1),以本科室保存的KP菌株基因组为模板,设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增OmpA全长序列并经同源重组酶连接至慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-N1。将该重组表达载体与慢病毒包装质粒pLP1,pLP2和pLPVSV-G共转染HEK293T细胞,收集慢病毒液并感染Raw264.7巨噬细胞,经有限稀释法筛选获得表达KP OmpA的Raw264.7单克隆细胞株。使用蛋白质印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)表达。组间比较采用t检验。结果成功包装出慢病毒并获得稳定表达KP OmpA的Raw264.7细胞系,KP OmpA稳转细胞系胞内NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β灰度值显著高于空载细胞系(1.17±0.01比0.71±0.01,t=31.170,P<0.01;2.25±0.06比1.43±0.07,t=8.909,P<0.05;1.82±0.06比1.25±0.01,t=8.900,P<0.05;1.41±0.06比0.58±0.01,t=12.860,P<0.01)。KP OmpA稳转细胞系细胞上清中IL-1β和IL-18表达量显著高于空载细胞系[(215.70±14.93)pg/ml比(20.37±9.86)pg/ml,t=10.920,P<0.01;(115.90±14.88)pg/ml比(15.40±4.72)pg/ml,t=6.434,P<0.05]。结论肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpA可以激活Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎症小体,并上调炎性因子IL-1β和IL-18表达。