PRMT5调控m6A修饰介导三阴性乳腺癌细胞对多柔比星敏感性的机制研究

目的探讨蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)通过调控RNA m6A修饰降低三阴性乳腺癌细胞对多柔比星(DOX)敏感性的分子机制。方法利用TCGA数据库分析PRMT5在乳腺癌组织中的表达水平及其与患者预后的相关性;构建稳定过表达和敲降PRMT5的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株;利用CCK-8和克隆形成实验,分析PRMT5对乳腺癌细胞DOX敏感性的影响;通过qRT-PCR和Western blotting等方法,检测在DOX作用下PRMT5对MDA-MB-231细胞m6A相关分子表达水平的影响;利用MeRIP-seq测序分析PRMT5调控DOX作用下m6A修饰显著差异的靶基因,并通过qRT-PCR检测靶基因的表达水平以及RNA稳定性。结果TCGA数据库分析结果显示,PRMT5在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达(P<0.05),并且高表达PRMT5预示不良预后;过表达PRMT5能够降低MDA-MB-231细胞对DOX的敏感性(P<0.01),敲降或者采用PRMT5抑制剂JNJ能显著增加MDA-MB-231细胞对DOX的敏感性(P<0.01,P<0.05)。PRMT5过表达可以显著抑制DOX所致的细胞m6A水平增加(P<0.01),特别是可以降低DNA损伤修复相关分子ERCC4、REV3L的RNA甲基化水平,提高这些分子的RNA稳定性。结论PRMT5通过降低MDA-MB-231细胞DNA损伤修复相关分子的RNA甲基化水平,提高其稳定性,进而导致细胞对DOX敏感性降低。

阿霉素、顺铂提升三阴性乳腺癌细胞RNA m6A甲基化水平及其机制探讨

目的:探讨DNA损伤类化疗药物阿霉素和顺铂对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的RNA m6A甲基化水平的影响及其相关机制。方法:利用MTT法检测阿霉素和顺铂对MDA-MB-231细胞存活率的影响;通过Western blot检测γ-H2AX蛋白表达;应用Dot blot检测细胞RNA m6A甲基化水平;通过RT-qPCR和Western blot分别检测RNA m6A甲基化酶METTL3、METTL14、METTL16和RBM15以及去甲基化酶ALKBH5和FTO的mRNA和蛋白水平。结果:阿霉素和顺铂均能显著降低MDA-MB-231细胞存活率,促进细胞的DNA损伤,同时提升细胞RNA m6A甲基化水平;阿霉素和顺铂处理后细胞RNA m6A甲基化酶mRNA和蛋白表达水平无明显变化,而去甲基化酶ALKBH5的表达显著减少。结论:诱发细胞DNA损伤的化疗药物阿霉素和顺铂可提升三阴性乳腺癌细胞RNA m6A甲基化水平,其机制与m6A去甲基化酶ALKBH5的降低有关。