过表达miR-21的骨髓间充质干细胞对化疗性卵巢早衰的修复作用

目的探讨过表达miR-21的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对化疗性卵巢早衰大鼠模型的修复作用。方法构建miR-21慢病毒表达载体(LV-miR-21),转染BMSCs构建miR-21-BMSCs。实验分为5组:正常组、模型组、miR-21组、BMSCs组、miR-21-BMSCs组,每组20只大鼠。大鼠腹腔内注射环磷酰胺(CTX)构建化疗性卵巢早衰大鼠模型。正常组及模型组大鼠双侧卵巢注射生理盐水,其余3组分别注射LV-miR-21、BMSCs、miR-21-BMSCs。检测各组大鼠动情周期、雌二醇(E_2)及卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及各级卵泡计数、卵巢颗粒细胞凋亡率。结果正常组大鼠动情周期不变,其余4组注射CTX后均出现动情周期紊乱,其中miR-21-BMSCs组恢复动情周期的大鼠数量明显多于其余3组。在注射CTX后30、45、60d,miR-21-BMSCs组卵巢重量及各级卵泡计数明显高于模型组、miR-21及BMSCs组(P<0.05);各组大鼠基础E_2、FSH水平差异无统计学意义,正常组大鼠E_2、FSH在实验期间无明显改变,其余4组大鼠E_2浓度下降、FSH浓度升高,miR-21-BMSCs组激素水平与miR-21组及BMSCs组相比差异均有统计学意义[E_2:F_(30d)=43.10,F_(45d)=43.57,F_(60d)=44.98,P<0.05;FSH:F_(30d)=14.71,F_(45d)=13.16,F_(60d)=15.20,P<0.05)];与模型组、miR-21组、BMSCs组相比,miR-21-BMSCs组颗粒细胞凋亡率明显下降(F_(15d)=27.20,F_(30d)=23.60,F_(45d)=21.80,F_(60d)=21.20,P<0.05)。结论 miR-21能增强BMSCs对化疗性卵巢早衰的治疗作用,显著减轻卵巢结构及功能损伤。

间充质干细胞过表达miR-21对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨过表达miR-21的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法构建miR-21慢病毒表达载体(LV-miR-21),转染BMMSCs获得稳定表达miR-21的BMMSCs(miR-21-BMMSCs)。培养Wistar大鼠卵巢颗粒细胞,实验分为5组:正常组、磷酰胺氮芥(PM)组、miR-21组、BMMSCs组、miR-21-BMMSCs组。正常组为颗粒细胞不加药,PM组加入30μmol/L的磷酰胺氮芥,miR-21组加入PM诱导颗粒细胞凋亡后转染LV-miR-21,BMMSCs组、miR-21-BMMSCs颗粒细胞培养基中加入PM 24h后分别与BMMSCs、miR-21-BMMSCs以1:1比例共培养。48h后采用流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡情况,qRT-PCR法检测miR-21、程序性死亡因子4(PDCD4)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)mRNA的表达量,Western blotting检测PTEN、PDCD4蛋白表达水平。结果正常组、PM组、miR-21组、BMMSCs组、miR-21-BMMSCs组的细胞凋亡率分别为10.4%±1.8%、33.4%±4.2%、27.0%±2.5%、28.0%±2.0%、19.6%±1.5%,5组间比较差异有统计学意义(F=59.35,P=0.00),其中miR-21-BMMSCs组细胞凋亡率明显低于miR-21组、BMMSCs组,但仍高于正常组。miR-21-BMMSCs组miR-21的表达量(4.0310±0.2314)明显升高,而PTEN、PDCD4的mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论 BMMSCs过表达miR-21可明显减少卵巢颗粒细胞的凋亡,其机制可能与对靶基因PTEN、PDCD4的调控作用有关。

热休克预处理骨髓间充质干细胞对化疗性卵巢早衰的疗效观察

目的探讨热休克预处理骨髓间充质干细胞(BMSCs)对化疗性卵巢早衰的疗效。方法分离、培养并鉴定大鼠BMSCs,42℃水浴处理BMSCs 1h。将125只Wistar雌性大鼠分为5组:正常对照组、模型组、假手术组、BMSCs组、热休克BMSCs组,每组25只。除正常对照组外,其余4组腹腔注射环磷酰胺建立化疗性卵巢早衰模型,建模结束后第1天,BMSCs组、热休克BMSCs组大鼠每侧卵巢各注射1×10~6个BMSCs、热休克预处理BMSCs,假手术组注射等体量生理盐水。各组均于移植后第1、15、30、45、60天分批处死5只大鼠,观察各组卵巢结构、卵泡数量、大鼠动情周期、血清雌二醇(E_2)和卵泡刺激素(FSH)水平及卵巢颗粒细胞凋亡情况。结果正常对照组大鼠动情周期无改变;模型组和假手术组大鼠在实验中动情周期持续紊乱;细胞移植后16~30d,热休克BMSCs组与BMSCs组开始有大鼠恢复正常动情周期,但两组间差异无统计学意义(P1-15d=1.0,P16-30d=0.358,P31-45d=0.325,P46-60d=0.5)。正常观察组激素水平基本平稳,始终高于其余4组。模型组和假手术组E_2水平持续下降,FSH水平持续上升。细胞移植后15d,热休克BMSCs组与BMSCs组大鼠的E_2水平开始明显高于模型组与假手术组(P<0.05),而FSH明显低于模型组及假手术组(P<0.05)。移植30d后,热休克BMSCs组E_2水平开始明显高于BMSCs组(P<0.05),而FSH水平则明显低于BMSCs组(P<0.05);细胞移植后第1天及第15天,模型组、假手术组、BMSCs组、热休克BMSCs组各级卵泡数均明显少于正常对照组(P<0.05);模型组及假手术组各级卵泡持续减少,而移植后第45、60天,热休克BMSCs组、BMSCs组各级卵泡数均明显多于模型组及假手术组(P<0.05),且热休克BMSCs组各级卵泡数明显多于BMSCs组(P<0.05)。细胞移植后第1天,模型组、假手术组、BMSCs组、热休克BMSCs组的卵巢颗粒细胞凋亡指数明显高于正常对照组(P<0.05),但4组间差异无统计学意义(P>0.05)。细胞移植第15、30、45、60天,BMSCs组和热休克BMSCs组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡指数均较细胞移植后第1天明显降低,且明显低于模型组及假手术组(P<0.05),且与BMSCs组相比,热休克BMSCs组颗粒细胞凋亡更少(P<0.05)。结论热休克预处理BMSCs能更为有效地修复化疗损伤的卵巢结构及内分泌功能。

热休克预处理大鼠骨髓间充质干细胞对化疗诱导卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用

目的骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)可促进卵巢血管生成,改善化疗所致的卵巢功能不全,修复卵巢功能,而热休克预处理可降低干细胞的凋亡率,提高干细胞的治疗效果。文章拟研究热休克预处理对MSCs的影响,进一步研究热休克预处理的间充质干细胞对化疗诱导卵巢颗粒细胞凋亡的作用。方法分离、培养及鉴定大鼠骨髓MSCs,采用42℃水浴1 h预处理。向MSCs中加入顺铂(5 mg/L)模拟化疗局部微环境。分为4组:空白对照组、热休克对照组、模型组、热休克模型组。空白对照组为不予其他处理的MSCs,热休克对照组为热休克预处理后的MSCs,模型组为顺铂(5 mg/L)作用后的MSCs,热休克模型组为热休克预处理后再予顺铂(5 mg/L)作用的MSCs。通过CCK-8法、Hoechst33342/PI、流式细胞仪检测法,探究热休克预处理对MSCs的增殖、凋亡及存活率的影响。分离、培养大鼠卵巢颗粒细胞(GCs),建立顺铂(5 mg/L)诱导GCs损伤的体外模型。分为4组:对照组、模型组、MSCs模型组、HS-MSCs模型组。对照组为未经处理的GCs;模型组为经顺铂(5 mg/L)作用后的GCs;MSC模型组、HS-MSCs模型组为GCs加入顺铂(5 mg/L)诱导凋亡后24h分别与MSCs、HS-MSCs以1∶1比例加入Transwell培养板中实现GCs与MSCs的共培养。通过流式细胞仪检测法、Hoechst33342/PI法,探究热休克预处理MSCs是否具有抑制化疗诱导的GCs凋亡的作用。结果在第3、4天热休克对照组MSCs增殖水平显著高于其他3组,MSCs凋亡率低于其他3组;与模型组相比,热休克模型组第3、4天细胞增殖水平显著增加(P<0.05),凋亡率显著下降(P<0.05)。与模型组凋亡率[(53.81±1.89)%]相比,对照组、MSCs模型组、HS-MSCs模型组[(31.13±2.81)%、(42.76±0.99)%、(36.72±0.96)%]显著下降(P<0.05);与MSCs模型组相比,HS-MSCs模型组凋亡率显著下降(P<0.05)。结论热休克预处理能提高MSCs的增殖水平及存活率,降低其凋亡率,热休克预处理的间充质干细胞可有效抑制化疗诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。

miR-21对化疗药物诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨慢病毒介导miR-21对化疗诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制。方法采用分子生物学方法构建miR-21慢病毒表达载体(LV-miR-21),分离培养大鼠卵巢颗粒细胞。分为正常组、磷酰胺氮芥(PM)组、miR-21组。正常组卵巢颗粒细胞培养基中不加PM,PM组加入30μmol/L的PM诱导卵巢颗粒细胞凋亡,miR-21组卵巢颗粒细胞培养基中加PM诱导凋亡24 h,随后转染LV-miR-21。48 h后采用流式细胞仪检测法检测3组卵巢颗粒细胞凋亡率,用荧光定量PCR及Western blot法检测同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)、程序性死亡蛋白4(PDCD4)的mRNA及蛋白质表达水平。结果正常组、PM组、miR-21组的凋亡率差异有统计学意义(F=78. 00,P=0. 00),miR-21组凋亡率低于PM组(P <0. 05),但仍高于正常组(P <0. 05)。3组的miR-21表达水平差异有统计学意义(F=1 226. 35,P=0. 00),miR-21组的miR-21表达水平显著高于正常组及PM组(P <0. 05)。3组PTEN的mRNA和蛋白质表达水平差异均有统计学意义(F=90. 37,P=0. 00; F=44. 34,P=0. 00),miR-21组的表达水平显著低于PM组(P <0. 05)。3组PDCD4的mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=198. 59,P=0. 00; F=60. 25,P=0. 00),miR-21组的表达水平显著低于PM组(P <0. 05)。结论 miR-21通过下调靶基因PTEN、PDCD4的表达,抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。

热休克预处理对化疗环境下骨髓间充质干细胞存活率的影响及机制

目的:探索热休克预处理(heat shock pretreatment,HSP)对化疗微环境下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的影响及其潜在机制。方法:探索HSP最佳条件,往热休克预处理BMSCs(heat shock pretreated bone marrow mesenchymal stem cells,HS-MSCs)培养基中加入顺铂,通过CCK-8检测细胞增殖率,Hoechst33342/PI测定存活率,流式细胞仪检测凋亡率。使用Western blot检测不同时间点HS-MSCs热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)、Hsp90、自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的表达。通过透射电镜观察自噬小体数量。结果:加入顺铂后,热休克模型组凋亡率明显低于模型组。此外,热休克模型组增殖速率较模型组增加,而表达亮蓝色/暗红色荧光的比例则低于模型组。HS-MSCs内Hsp70和Hsp90的表达随时间推移逐渐上调,并在48 h后达峰值。同时,细胞内自噬小体减少、Beclin1表达降低、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值下降。结论:HSP能够提高化疗微环境下BMSCs的存活与抗凋亡能力,其作用可能与HSP增强Hsp70及Hsp90的表达、减弱自噬水平有关。

多囊卵巢综合征患者血清adropin的表达及意义

目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者血清adropin的表达水平及其临床意义。方法以未经治疗的初诊PCOS患者53例作为PCOS组,以21例健康青年女性作为对照组。通过ELISA试剂盒对两组血清中的adropin进行定量,并同时测定血清中的性激素[睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)]、血糖、血脂及胰岛素等指标。结果 PCOS组adropin水平明显低于对照组(P=0.000),PCOS组T(P=0.012)、LH(P=0.027)、FSH(P=0.021)、TG(P=0.029)、LDL(P=0.016)和空腹胰岛素(P=0.04)、餐后1 h(P=0.002)及2 h(P=0.001)的胰岛素水平以及HOMA-IR(P=0.016)均明显高于对照组。adropin与HOMA-IR呈负相关(r=-0.382,P=0.005)。adropin的ROC曲线AUC=0.791(95%CI 0.690~0.871),灵敏度为98.11%,特异度为63.64%,临界值为3.8 ng/m L。结论 PCOS患者血清adropin水平降低,且与胰岛素水平及HOMA-IR呈负相关,在PCOS的诊断上有一定的价值,有望成为诊断PCOS的新指标和潜在治疗新靶点。

Peli1对免疫性早发性卵巢功能不全小鼠调节性T细胞生物学特性的影响

目的Peli1对免疫性早发性卵巢功能不全(POI)小鼠调节性T细胞(Treg)的生物学特性尚未阐明。文章旨在探讨Peli1对免疫性POI小鼠Treg增殖、凋亡及功能的影响。方法从小鼠脾中分离Treg细胞,采用分子生物学方法构建过表达Peli1慢病毒载体,转染Treg细胞。实验分为6组:正常空白组(正常小鼠Treg细胞)、正常上调组(正常小鼠Treg细胞+过表达Peli1慢病毒)、正常空载组(正常小鼠Treg细胞+空载病毒)、模型空白组(POI小鼠细胞Treg细胞)、模型上调组(POI小鼠Treg细胞+过表达Peli1慢病毒)、模型空载组(POI小鼠Treg细胞+空载病毒)。采用qRT-PCR及Western blot检测各组Peli1的mRNA及蛋白水平,CCK8法检测Treg细胞增殖,Annexin V-APC/PI法检测Treg细胞凋亡率,流式细胞仪检测Teff细胞增殖水平评估Treg细胞免疫抑制功能,ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β表达水平。结果模型上调组Peli1 mRNA及蛋白相对表达水平显著高于模型空载组、模型空白组(P<0.05);正常上调组Peli1 mRNA及蛋白相对表达水平显著高于正常空载组、正常空白组(P<0.05)。48 h、72 h和96 h时,模型上调组Treg细胞增殖水平高于模型空白组及模型空载组(P<0.05),正常上调组Treg细胞增殖水平显著高于正常空白组及正常空载组(P<0.05)。模型上调组Treg细胞凋亡率[(37.13±0.95)%]显著低于模型空载组[(45.27±0.95)%]与模型空白组[(41.95±2.08)%],差异有统计学意义(P<0.05);正常上调组Treg细胞凋亡率[(26.49±1.37)%]显著低于正常空载组[(33.60±2.09)%]与正常空白组[(35.20±3.18)%],差异有统计学意义(P<0.05)。流式结果显示,模型上调组Treg细胞对Teff细胞的抑制率显著高于模型空载组、模型空白组(P<0.05);正常上调组Treg细胞对Teff细胞的抑制率显著高于正常空载组、正常空白组(P<0.05)。结论过表达Peli1促进POI小鼠Treg细胞增殖,抑制凋亡,增强免疫抑制功能,为治疗免疫性POI提供了新思路。

热休克预处理大鼠骨髓间充质干细胞预防顺铂诱导的卵巢颗粒细胞凋亡

目的探讨热休克预处理大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)预防顺铂诱导的卵巢颗粒细胞(GC)凋亡的效果。方法分离培养大鼠骨髓MSC,设置不同热休克预处理时间,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,确定最佳热休克预处理条件。以顺铂模拟化学治疗的卵巢局部微环境,将MSC分为对照组、热休克预处理组、顺铂组及热休克预处理+顺铂组,检测各组MSC凋亡情况。分离、培养大鼠GC,采用顺铂诱导卵巢GC损伤的体外模型,将GC分为对照组、顺铂组、MSC预防+顺铂组、热休克预处理MSC(HS-MSC)预防+顺铂组,检测各组GC的凋亡情况。结果 热休克预处理能够减轻MSC凋亡,最佳热休克预处理条件为42 ℃热休克处理1 h。在顺铂模拟化学治疗的卵巢局部微环境中,热休克预处理+顺铂组MSC凋亡率为(11.94±0.63)%,低于顺铂组的(14.30±0.80)%,差异有统计学意义(P<0.05)。在顺铂诱导卵巢GC损伤的体外模型中,顺铂组GC的凋亡率为(53.81±1.89)%,HS-MSC预防+顺铂组GC的凋亡率为(39.88±1.65)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论热休克预处理能够提高化学治疗环境下MSC的抗凋亡能力。热休克预处理的MSC能够抑制顺铂诱导的卵巢GC凋亡,有预防性保护作用。