N-糖基化对TNFR-Fc融合蛋白结构稳定性和生物活性的影响

目的:探究糖基化对TNFR-Fc融合蛋白结构、稳定性和生物活性的影响。方法:经N-糖酰胺酶F(PNGase F)切除TNFR-Fc融合蛋白所连的糖链,用SEC-HPLC、傅里叶变换红外光谱法和荧光光谱法等方法分析N-糖基化和去糖基化后重组蛋白的结构变化,通过加速稳定性实验和毛细管电泳检测对比其酶切前后稳定性变化,其生物活性的差异经细胞杀伤实验进行比较。结果:去糖基化后TNFR-Fc融合蛋白质分子质量略有降低,其构象、荷电性质及生物活性没有明显差异;然而切除N-糖链,TNFR-Fc二聚体的稳定性降低,蛋白质降解物明显增加。结论:去N-糖基化对TNFR-Fc的构象、荷电性质和生物活性的影响并不显著,但会影响TNFR-Fc融合蛋白的稳定性。

CHO-DG44细胞瞬时转染条件的优化

目的优化CHO-DG44细胞瞬时转染的条件。方法采用TubeSpin一次性生物反应器,以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因,氯醚酰亚胺(Polyether imide,PEI)为转染试剂,将质粒pIRESneo3-eGFP瞬时转染CHO-DG44细胞,优化瞬时转染的基本条件[细胞密度、DNA浓度和DNA:PEI比例(w/w)]以及其他条件(换液、渗透压和温度),采用优化的条件转染质粒pIRESneo3-eGFP,流式细胞术检测细胞转染效率,生物发光仪检测相对荧光强度。结果 CHO-DG44细胞瞬时转染的最佳条件为:采用XLG-P8培养基进行转染,细胞密度为2×106个/ml,DNA浓度为6.25μg/5 ml,DNA∶PEI(w/w)比例为1∶5;转染后4 h更换新鲜培养基,添加30 mmol/L NaCl,并于31℃继续培养。在此条件下,CHO-DG44细胞的瞬时转染效率可达81.45%,相对荧光强度可达9×105RFU/106cells。结论优化了CHO-DG44细胞瞬时转染的条件,为下一步药物蛋白的研发奠定了基础。

悬浮培养昆虫细胞SF9瞬时表达重组蛋白的条件优化(英文)

瞬时基因表达(TGE)是一种省去筛选高表达细胞株步骤,快速获得重组蛋白质的技术。昆虫细胞作为一种广泛使用的蛋白表达系统,在国内外关于它的瞬时基因表达的研究比较少。这篇文章进行了以昆虫SF9细胞在悬浮培养条件下进行瞬时表达eGFP和肿瘤坏死因子受体融合蛋白(TNFR-Fc)的条件优化,以期为外源蛋白在昆虫细胞中瞬时表达打下基础。经优化后,转染效率达到37%,重组TNFR-Fc达到700μg/mL。