A、B、J亚群禽白血病病毒混合感染的鉴定及gp85基因序列分析

【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组织接种DF-1细胞进行病毒分离,通过PCR、ELISA及间接免疫荧光试验(IFA)等方法进行亚群鉴定,进一步对分离株gp85基因的相似性和变异情况进行分析。【结果】剖检结果可见病死鸡肾脏、脾脏肿大,肺脏出血,表面可见灰白色肿瘤结节;组织匀浆接种DF-1细胞后,ELISA检测发现细胞上清P27抗原呈阳性;IFA检测发现,感染细胞里有特异性绿色荧光;PCR鉴定能同时扩增出A(692 bp)、B(847 bp)和J(545 bp)亚群的特异性条带。鉴定结果表明,从该病死鸡中分离到A、B和J亚群ALV毒株,分别命名为HBYC2022-A、HBYC2022-B和HBYC2022-J。分离株gp85基因核苷酸相似性分析显示,HBYC2022-A与江苏株JS-A1201相似性最高,为99.6%;HBYC2022-B与江苏株JS-B1204相似性最高,为99.7%;而HBYC2022-J与黑龙江株PK19FA01、广西株GX20YL12 J及安徽株AHaq02相似性均为100%。此外,分离株gp85基因高突变区域(hr1、hr2)氨基酸序列并未出现特殊点突变。【结论】鸡群存在A、B和J不同亚群ALV的混合感染情况,提示国内养禽场需提高警惕并加强针对ALV各亚群的流行病学调查。

2015～2017年湖北地区禽白血病病毒的分离及gp85基因序列分析

为了解2015～2017年湖北地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avi-an leukosis vrius,ALV-J)流行情况及流行株的分子特征,从湖北省地方品种鸡中分离到10株ALV-J,对其gp85基因进行PCR扩增、克隆、序列测定及分析。结果显示:10个分离毒株的gp85基因片段大小均为924 bp,与预期一致;10个分离毒株之间核苷酸和氨基酸序列相似性分别为91.4%～100%、86.4%～100%,其中9株与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为96.8%～98.9%,并且在一个分支上面。结果表明:湖北省部分地方品种鸡不同程度感染ALV-J,分离毒株的变异主要围绕着原型株HPRS103改变,应加强地方品种鸡ALV的净化工作。

禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(avian Pasteurella multocida,Pm)四环素(Tetracycline,Tet)敏感株与耐药株(MIC=32μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Tet敏感株与耐药株进行双向测序,通过GO、KEGG和ARDB数据库对表达差异基因进行注释和富集性分析。结果显示,共筛选出442个差异表达基因,其中包括103个上调基因和339个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数富集于核糖体结构成分、rRNA结合、跨膜运输和离子转运等生物过程;对差异表达基因进行信号通路富集性分析,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中;对差异表达基因进行耐药基因注释(ARDB),发现其中的耐药基因主要为核糖体保护蛋白和外排系统两类。本研究表明禽源Pm对四环素耐药的耐药机制可能与细胞膜上ABC转运蛋白的过量表达以及核糖体保护蛋白有关。

ALV-J、REV和MDV多重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可同时检测J亚群禽白血病病毒(ALV)、网状内皮增生症病毒(REV)和马立克病病毒(MDV)的方法,本研究以ALV-J的ENV基因、REV的LTR区以及MDV的MEQ基因为检测对象,建立了可同时检测ALV-J、REV、MDV的多重荧光定量PCR方法并对其特异性、灵敏性、稳定性进行了研究。结果显示,该方法仅可特异扩增3种肿瘤病病毒的基因,对禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒等核酸扩增均呈阴性;ALV-J、REV和MDV的最低核酸检测限分别为35 copies/μL、5.1 copies/μL和62 copies/μL;此外,批内与批间重复试验Ct值的变异系数均小于2%。利用此方法对166份送检样品进行检测,其中ALV-J、REV和MDV检出率分别为25.3%、7.2%和5.4%,混合感染检出率为3.6%。以上结果表明,本方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,能够同时检测ALV-J、REV和MDV,可用于禽肿瘤病的鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

湖北地方鸡种鸡场弱毒疫苗ALV的分离与鉴定

为探明湖北省地方鸡种鸡场禽白血病净化后出现反弹的原因,通过病毒分离、PCR扩增、基因测序及分子生物学分析,有针对性地检测了种鸡场活疫苗ALV污染情况。结果表明,从活疫苗中分离出一株ALV是外源性ALV-J亚群病毒。

星状病毒感染免疫应答机制的研究进展

星状病毒(AstV)能够感染多种多样的物种,包括人类、哺乳动物和禽类。一旦感染,可诱发肠炎、肾炎以及神经疾病等,但人们对星状病毒感染的免疫反应知之甚少。随着细胞培养系统和动物模型的建立,人们逐渐提高了对星状病毒感染和发病机制的认识。本文综述了目前星状病毒感染免疫应答的机制,并强调了研究中发现的一些关键问题,为治疗和控制星状病毒感染提供新的研究思路。

鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测

通过PCR方法,扩增得到鸭I型干扰素β(IFN-β)基因启动子功能区域的DNA片段和其4个重复NF-κB结合位点的DNA片段,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建了包含鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点的荧光素酶报告质粒pduIFN-β-luc和4×NF-κB-luc;分别将构建的两个报告质粒与海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK用JetPEITM转染试剂共转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在转染24 h后,用poly(I∶C)刺激转染细胞,结果表明,与未刺激组相比,刺激组的荧光素酶活性均显著增加。为进一步研究鸭天然免疫信号通路提供了重要的研究工具。

体外诱导禽巴氏杆菌链霉素耐药株及耐药机制的初步分析

为了研究多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)对链霉素(Streptomycin,Str)药物敏感性变化及其耐药机制,采用体外诱导法对禽源Pm亲本敏感株(C48-1)进行诱导后成功获得Str耐药株,并对Str耐药株的最小抑菌浓度(MIC)、生化特性、生长曲线、耐药稳定性、耐药基因点突变以及耐药逆转性进行了研究。结果表明,与亲本株相比,Str耐药株生化特性与生长曲线无显著差异,MIC值由8μg/m L上升至1 024μg/m L;发现耐药基因Str A、Str B,且核糖体基因rps L编码的氨基酸发生了Lys43→Thr突变;耐药逆转性试验中羰基氰氯苯腙(CCCP)将Str耐药株MIC值降为16μg/m L。逐步递增药物浓度可以诱导禽源Pm对氨基糖苷类药物的耐药性,其耐药机理为磷酸转移酶类对氨基糖苷类抗生素结构的修饰作用,核糖体靶位点突变和外排泵的过量表达。

禽巴氏杆菌链霉素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Pm)链霉素(Str)敏感株与耐药株(MIC=1024μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Str敏感株与耐药株进行双向测序,筛选得到差异表达基因,通过GO、KEGG和ARDB数据库对差异表达基因进行分组和富集性分析,并利用荧光定量PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。结果显示,共筛选获得625个差异表达基因,其中包括581个上调基因和44个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数发挥细胞膜转运功能;对差异表达基因进行信号通路富集性分析显示,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与双组分系统代谢途径中;采用ARDB对差异表达基因进行耐药基因分析,显示其中的耐药基因主要为氨基糖苷转移酶类和外排系统两类。本研究结果表明,禽源Pm对Str的耐药机制可能与细胞膜上多药外排泵的过量表达和氨基糖苷转移酶类灭活抗菌药物有关。同时,也为进一步研究禽源Pm对Str的耐药机制奠定了基础。

2株鸭源新型鹅细小病毒分离鉴定及遗传进化分析

为更好地了解能引起鸭短喙侏儒综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性,对从湖北地区采集的病样进行病原检测,经鸭胚接种成功分离到两株NGPV,分别命名为HBXY07和HBWH07,并对其进行全基因组序列分析和重组鉴定。全基因组系统发育树和序列比对表明水禽细小病毒主要有两个分支,分别为GPV和MDPV,分离株HBXY07和HBWH07和其他NGPV株同处于GPV组内的一个独立分支上,两者同源性为96.6%;对分离株非结构蛋白NS的氨基酸序列分析发现两者序列一致,与经典GPV相比,有16个突变位点;对分离株衣壳蛋白VP的氨基酸序列分析显示,两者间有11个突变位点,其中第487位突变(T→A)是HBXY07株所独有的;重组分析表明分离株HBXY07和HBWH07潜在的主要亲本分别为HN1P和GXN45株,潜在的次要亲本均为RC45。研究结果为进一步研究NGPV的遗传进化及致病性提供依据,为水禽细小病毒疫苗的使用和研发提供理论基础。

多种单味中药对禽多杀性巴氏杆菌C48-1的抑菌作用研究

试验选取厚朴酚、黄藤素、秦皮、大黄素和黄柏5种中药提取物,采用药敏纸片法和布氏肉汤稀释法对禽多杀性巴氏杆菌C48-1进行抑菌试验。体外抑菌试验结果表明,厚朴酚、黄藤素和秦皮提取物的抑菌圈大小分别为22.0、11.3、15.6 mm,最小抑菌浓度(MIC)分别为8、256、64μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)分别为16、512、256μg/mL;大黄素和黄柏提取物对C48-1没有抑菌作用;厚朴酚的抑菌作用最强,秦皮次之,黄藤素最弱。培养禽多杀性巴氏杆菌C48-1时,培养基中加入厚朴酚含量为6μg/mL时,细菌的生长速度相比对照组受到明显抑制,当药物浓度为MIC(8μg/mL)值时,禽多杀性巴氏杆菌C48-1生长被完全抑制。从体内抑菌试验结果可知,厚朴酚对禽多杀性巴氏杆菌C48-1侵染江汉鸡的保护力最高,为50%。该结果为进一步研制中药制剂预防禽多杀性巴氏杆菌病提供了理论基础。

鸭IFN-β启动子区域IRF1结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测

构建并鉴定鸭Ⅰ型干扰素β(IFN-β)基因启动区域的IRF1结合位点荧光素酶报告基因载体,并进行转录活性分析。通过PCR方法从鸭脾脏cDNA中克隆得到鸭干扰素启动子区域IRF1结合位点,通过连接转化亚克隆至含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建得到4个重复鸭源IRF1结合位点的荧光素酶报告基因载体4×IRF1-luc;用JetPEITM转染试剂将构建的报告基因转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在poly(I∶C)的刺激下,荧光素酶活性显著增加。

没食子酸抑制生物被膜机制的初步研究

鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌是危害家禽养殖业和公共卫生的重要病原菌,生物被膜的形成是其持续和反复感染的重要原因。为探究没食子酸对二者生物被膜形成的影响,本研究采用微量稀释法测定没食子酸对鸡白痢沙门菌CVCC519和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC,共孵育测定最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜清除浓度(MBEC);采用结晶紫染色和硫酸-苯酚法分别测定其对试验菌生物被膜及胞外多糖(EPS)的抑制率,并利用环境扫描电镜观察生物被膜形态;最后采用qRT-PCR方法检测其对试验菌生物被膜形成相关基因表达量的影响。结果显示,没食子酸对CVCC519和ATCC 25923的MIC分别为4 mg/mL和8 mg/mL,MBC分别为8 mg/mL和16 mg/mL,MBIC均为8 mg/mL,MBEC均为16 mg/mL。此外,没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下,能有效抑制其生物被膜形成和EPS的产生。环境扫描电镜观察发现,没食子酸处理使生物被膜生成量显著减少,结构松散、变薄。qRT-PCR检测结果显示,没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下,能显著抑制CVCC519菌毛基因csgA、csgD,纤维素基因bcsA、adrA,群体感应系统相关基因luxS的表达,而对ATCC 25923的ica操纵子和luxS并无显著调控作用。以上结果表明,没食子酸在不显著影响鸡白痢沙门菌生长的浓度下,可通过下调其生物被膜形成相关基因的表达,减少胞外基质的合成,产生抗生物被膜的作用;也能通过ica非依赖途径有效抑制金黄色葡萄球菌胞外多糖的分泌和生物被膜的形成。本研究为没食子酸防控鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌生物被膜提供理论基础。

基于鸡白痢沙门菌LPS的D群沙门菌抗体间接ELISA检测方法的建立

通过热酚水法提取并纯化鸡白痢沙门菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),以LPS作为包被抗原,建立D群沙门菌抗体间接ELISA检测方法。结果显示,通过方阵滴定法等确定抗原包被质量浓度为2.233 mg/L;血清最佳稀释度为1∶200,最佳作用时间为60 min;最适封闭条件为5%脱脂乳封闭60 min;酶标二抗最适工作质量浓度为1∶8000,作用60 min;底物显色时间为15 min;阴阳性判定标准为S/P值≥0.5。特异性、敏感性和重复性验证表明,该方法可特异性检测鸡白痢沙门菌等D群沙门菌的阳性血清,与鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌等家禽病原菌的阳性血清无交叉反应,其检测灵敏度是鸡白痢平板凝集的400倍,批间重复和批内重复变异系数均小于10%。对临床血清的检测结果表明,该方法与Biochek公司的D群抗体检测试剂盒的阳性符合率为94.67%,阴性符合率为98.11%,总符合率为98.59%。结果表明,该检测方法可用于临床鸡白痢沙门菌等D群沙门菌感染的抗体检测。