弓形虫棒状体基部蛋白38(ROP38)通过Toll样受体4(TLR4)诱导小鼠树突状细胞成熟

目的体外分析Toll样受体4(TLR4)诱导感染弓形虫棒状体基部蛋白38(ROP38)对小鼠树突状细胞(DC)成熟的影响。方法以异硫氰酸胍方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,采用PCR扩增ROP38,将ROP38连接至原核表达载体构建重组质粒pG EX-4T-ROP38;利用ProtS cale在线软件分析ROP38蛋白的亲水性和疏水性,利用DNAStar8.0分析ROP38蛋白的抗原表位;将重组质粒pG EX-4T-ROP38转化E.coli Rosetta感受态细胞,挑取阳性单菌落用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达,Western blot法检测ROP38蛋白水平。利用0.28 mg重组ROP38蛋白刺激小鼠骨髓来源DC,同时采用TLR4抗体封闭和空白处理为对照组。采用流式细胞术分析CD11c表达水平,运用SPSS23.0软件进行单因素方差分析。结果成功扩增弓形虫ROP38基因,其大小为516 bp,测序结果显示所获基因与GenB ank中已报道的序列(XM_002366710.2)同源性高达99%;ROP38基因序列生物信息学分析表明,ROP38蛋白含有5个α螺旋,5个β折叠,5个亲水性区域和8个可预测的抗原表位;重组质粒pG EX-4T-ROP38经IPTG诱导后,表达蛋白质的相对分子质量(Mr)为45 000,主要以包涵体形式存在。ROP38抗原刺激小鼠源DC后,其CD11c+表达水平明显高于TLR4抗体封闭组和空白对照组。结论 TLR4可诱导ROP38刺激小鼠DC的成熟。

自噬相关5蛋白对刚地弓形虫刺激树突状细胞成熟的影响

目的探讨自噬相关5 (ATG5)蛋白对刚地弓形虫(简称弓形虫)体外刺激树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法采用TRIzol法提取昆明小鼠总RNA,反转录为cDNA,经PCR扩增获得ATG5基因。构建重组质粒pET-32a-ATG5,转入大肠埃希菌Rosetta株中表达,尿素纯化后用抗His标签单抗蛋白质印迹(Western blotting)鉴定ATG5。分离鼠源DCs,用弓形虫体外感染DCs。感染实验分为3组:对照组(仅含DCs)、弓形虫组(弓形虫+DCs)和ATG5蛋白组(ATG5蛋白+弓形虫+DCs),每组设3次重复,各组弓形虫速殖子(1×10~4个)同时加入到DCs中, 37℃、 5%CO2共培养2 h。其中, ATG5蛋白组弓形虫在感染DCs前,预先与ATG5蛋白(50μg)在体外作用2 h。采用流式细胞术检测CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数中比例的变化,分析DCs的成熟情况,评价ATG5蛋白对弓形虫体外刺激DCs成熟的影响。结果ATG5扩增产物约为729 bp,ATG5蛋白相对分子质量(M_r)约为46 000。Western blotting检测结果显示,重组ATG5蛋白具有良好的反应原性。流式细胞术结果显示,对照组、弓形虫组、 ATG5蛋白组中CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数的比例分别为(13.3±0.5)%、(52.5±0.3)%和(47.8±0.6)%,弓形虫组和ATG5蛋白组差异有统计学意义(P <0.01),对照组与其他两组的差异有统计学意义(P <0.01)。结论ATG5蛋白可降低弓形虫体外刺激DCs成熟的能力。