基于Dhori病毒GP蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究利用原核表达系统表达Dhori病毒(DHOV)糖蛋白(GP),以此为抗原建立间接ELISA检测方法。根据DHOV-GRT169毒株GP基因设计引物并扩增得到去除跨膜区与信号肽的基因片段,构建了重组表达质粒p ET-32a-GP,测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组GP蛋白。以DHOV阳性山羊血清为一抗,经Western-blot检测纯化蛋白后,以纯化的p ET-32a-GP为包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立检测DHOV血清抗体的间接ELISA检测方法,评价其重复性、敏感性和特异性。采用建立的间接ELISA检测方法检测新疆部分地区采集的不同动物血清样本中DHOV抗体。结果显示,pET-32a-GP原核表达质粒构建正确,GP蛋白大小约为66.8 ku,反应原性良好;ELISA条件优化确定的最佳包被浓度为4μg/m L、一抗稀释度为1∶1000、一抗孵育时间为30min、二抗稀释度为1∶3000、二抗孵育时间为30 min、TMB显色时间为4 min;重复性试验结果表明,批内与批间变异系数(CV)均<10%;敏感性试验表明,当阳性血清稀释度为1∶1400时具有良好的敏感性;特异性试验表明,建立的间接ELISA检测方法检测GTV、CCHFV和TAMV时呈阴性反应;随机选取343份采于新疆不同地区的动物血清进行ELISA检测,检出48份血清结果呈阳性,阳性检出率为13.99%。该检测方法的建立为DHOV的流行病学分析提供了基础,为进一步研究DHOV GP蛋白的生物学功能、检测试剂盒的开发以及疫苗的研制提供了理论依据。