一氧化氮抑制大鼠空肠平滑肌收缩

目的 观察神经性一氧化氮合酶(nNOs)在空肠组织内的分布和一氧化氮(NO)对空肠平滑肌相位性收缩的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法 利用免疫组织化学技术和张力换能器分别测定nNOS在空肠组织内的分布和空肠平滑肌的收缩张力。结果 空肠平滑肌胞浆内有大量的nNOS分布,NO对大鼠空肠平滑肌收缩张力幅度的抑制呈浓度依赖性,对张力频率和时程没有明显影响。阻断β受体时,NO抑制张力的幅度,不影响频率和时程。阻断α或M受体时,NO对张力的幅度、频率和时程均抑制,并且阻断M受体时,NO对张力的频率和时程抑制有时间依赖性。正常张力幅度2.83±0.57mN,频率26.97±6.28次／min,时程2.25±0.24s,propranolol+L-Arg分别为1.47±0.46mN(P<0.01),25.53±2.99次／min(P>0.05),2.48±0.22 s,(P>0.05)。phen-tolamine+L-Arg分别为1.29±0.53 mN(P<0.01),22.93±1.75次／min(P<0.05),2.80±0.23s,(P<0.05)。atropine+L-Arg分别为1.72±0.74mN(P<0.05),17.92±4.93次／min(P<0.01),3.68±1.11 s,(P<0.01)。结论 空肠平滑肌胞浆内有大量的nNOS分布,NO对空肠平滑肌相位性收缩有抑制作用,这种作用与α、β、M受体有关。

一株耐盐细菌的16S rRNA基因序列分析

从舟山群岛滩涂土壤中获得了海水和底泥样品,并从中提取到了一株耐盐细菌,通过用不同盐浓度的培养基培养,挑取单菌落,反复划线纯化,得到了耐盐菌的单菌落。通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的提取、16S rRNA的PCR扩增及克隆、16S rRNA的全序列分析等手段,对该菌株的16S rRNA的基因序列进行了研究。

一株嗜盐细菌的16SrRNA基因序列分析

目的:从舟山深海海泥中获得了底泥样品,并从中提取到了一株嗜盐细菌。方法:通过用不同盐浓度的培养基培养,挑取单菌落,反复划线纯化,得到了嗜盐菌的单菌落,通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的提取、16SrRNA的PCR扩增及克隆、16SrRNA的全序列分析等手段。结果:得到该菌株的16SrRNA的基因序列。结论:该株嗜盐菌是一株新色盐杆菌。

露蜂房蛋白抑制大鼠支气管平滑肌细胞体外增殖的可能机制

目的观察露蜂房蛋白[NVP(1)]对大鼠支气管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其可能机制。方法用原代细胞培养、MTT法、流式细胞术和免疫印迹法检测细胞增殖。结果6.4×10-3g/L的NVP(1)明显抑制支气管平滑肌细胞增殖,并且阻断在细胞周期的G1期(对照组G1期为64.6%,NVP(1)处理组为90.5%)。NVP(1)能增强细胞周期蛋白激酶抑制剂(P21)蛋白的表达,降低细胞周期蛋白激酶(cdk2)蛋白的表达。结论NVP(1)阻断支气管平滑肌细胞增殖于细胞周期的G1期。

低电导钙激活的钾通道(rSK3，rIK)抑制露蜂房蛋白1(NVP(1))抗细胞增殖作用

目的研究rSK3,rIK通道在细胞增殖中的作用。方法用凝胶层析和液相色谱从露蜂房水提物中分离一种纯蛋白,并检测此蛋白的抗细胞增殖作用;转染;Southern blot检测rSK3,rIK基因;细胞计数检测SK通道在细胞增殖中的作用。结果从露蜂房水提物中分离一种纯蛋白,分子量为6.6 ku,命名为NVP(1),能抑制Hek-293细胞增殖。Southern blot检测转基因rSK3,rIK成功。转rSK3,rIK基因后,能消减NVP(1)抗细胞增殖的作用。结论rSK3,rIK促进细胞增殖。

MCHR2在豚鼠大脑组织内的表达

肥胖症是当今危急人类健康的一大难题.研究肥胖的机制,并达到防御和治疗肥胖症是研究的最终目的.自2001年以来,研究发现,黑色素浓集激素受体2(melanin-concentrating hormonereceptor-2,MCHR2)与肥胖间存在紧密联系.但研究进展缓慢,主要瓶颈是没找到合适的动物模型.本课题通过对多种动物的筛选,首次发现豚鼠大脑中存在MCHR2的高度表达,并运用RT-PCR、Northern印迹和Western印迹等方法进行了验证.这一结果为将豚鼠作为MCHR2功能研究的动物模型提供了实验依据.

DNA、RNA和蛋白质教学结合最新科研方法探讨

DNA半保留复制、RNA不对称转录和蛋白质生物合成是生物化学教学的重点和难点,学生学习枯燥乏味。将最新的科学研究方法如荧光定量PCR,小干扰RNA,条件性基因敲除贯穿于教学,提高学生的学习兴趣和主动学习的积极性,培养学生的科学研究能力。

麻黄碱对支气管平滑肌细胞增殖的影响

在前人工作的基础上,采用一种更简省的方法分离培养支气管平滑肌细胞;并且利用显微镜观察和MTT的方法,研究了麻黄碱对支气管平滑肌细胞形态和增殖的影响。结果表明:麻黄碱对支气管平滑肌细胞的形态没有明显影响,但是对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用,并进一步阐述了麻黄碱治疗哮喘等呼吸系统疾病的作用机理。

麻黄碱抑制支气管平滑肌细胞增殖的机制

BK通道(large-conductance Ca2+-activated K+ channel)是一种大电导、电压和钙离子依赖的钾通道,存在于哺乳动物几乎所有的组织中。β1亚基是首次从平滑肌细胞中分离到的一种BK通道辅助亚基。麻黄作为一种β肾上腺素受体激动剂,是一味治疗哮喘的常用中药。利用RT-PCR和膜片钳等技术,研究麻黄治疗哮喘的作用机制。结果表明:麻黄碱(ephedrine,Eph)作为麻黄的一种主要成分,显著抑制支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)的增殖和BK通道β1亚基的表达,但是对BK通道的电流没有显著影响。

沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.

GABA对小鼠回肠平滑肌自主收缩活动的影响

目的:观察GABA对小鼠回肠平滑肌运动功能的影响,探讨GABA的作用与β受体、NO之间的关系.方法:以离体回肠收缩张力的变化为指标,观察GABA的作用,GABAA受体抑制剂木防己苦毒素picrotoxin,β受体的阻断剂propranolol,NOS抑制剂L-NNA,cGMP合成酶的抑制剂ODQ对GABA作用的影响.结果:GABA抑制小鼠回肠平滑肌自主收缩活动.1×10-6和1×10-3mol/LGABA抑制率分别为34.71±7.35%和22.23±4.69%.picrotoxin没有改变GABA的抑制作用.L-NNA减弱GABA的抑制作用,ODQ也减弱GABA的抑制作用.NO供体L-Arg(5×10-7mol/L)使GABA(1×10-6mol/L)的抑制效应减弱,但不影响GABA(1×10-3mol/L)的抑制作用.propranolol(3×10-6mol/L)减弱GABA的抑制效应.结论:GABA对小鼠回肠自主收缩有抑制作用,这种作用可能需要cGMP和No的参与;β受体兴奋时对GABA抑制效应也有一定的影响.

拟斯卑尔脱山羊草基因的克隆与表达研究

Avenin-like基因是近年来发现的一类新基因。根据小麦avenin-like基因的保守序列,设计合成了一对特异性引物,对拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides,SS)的基因组DNA进行avenin-like基因扩增、克隆、序列测定和表达分析,发现了一个新型avenin-like基因。基因长855bp,编码284个氨基酸残基,分子量约为33kD。Southernblot结果表明其属于多基因家族。RT-PCR证实了avenin-like基因在籽粒胚乳中特异性表达。其对应的氨基酸序列含有18个半胱氨酸残基,可以形成7对分子内二硫键。研究表明Avenin-like蛋白是一类新型的储藏蛋白。这为小麦加工品质的改良提供了理论依据和遗传资源。

去甲肾上腺素对一氧化氮在小鼠十二指肠肌条收缩中作用的影响机制

目的:观察一氧化氮(nitric oxide,NO)对离体小鼠十二指肠肌条收缩幅度及去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)对NO作用的影响;探讨NA和NO之间的关系及影响机制. 方法:将分离的小鼠十二指肠肌标本置于10 mL 37±1℃新鲜配置的Krebs液的浴槽中,从浴槽底部持续通入950 mL/LCO2和50 mL/LO2的混合气体.通过张力换能器记录张力变化,观察NO对十二指肠肌条收缩幅度及NA对No作用的影响,用多种拮抗剂或抑制剂左旋-硝基精氨酸(L-NNA)、酚妥拉明、ODQ探讨NA 与NO之间的关系. 结果:L-Arg对肌条的收缩幅度有明显的抑制作用, 在浓度2×10-2-2×10-6mol/L范围内呈剂量-效应关系.除2×10-6mol/L组外,其余各浓度的L-Arg与对照组均有显著性差异(P<0.001).NA对肌条的收缩幅度有明显的抑制作用,在浓度1.2×10-4-1.2×10-8mol/L范围内呈剂量-效应关系.除1.2×10-8mol/L组外,其余各浓度的NA与对照组均有显著性差异(P<0.001).用无反应剂量1.2×10-8mol/L的NA孵育标本后加入浓度为2×10-3,2×10-4,2×10-5,2×10-6mol/L 的L-Arg对肌条收缩幅度的抑制作用明显增强,与单独L-Arg组的作用相比差异有显著性(P<0.001);而2×10-2mol/L L-Arg组与单独L-Arg组的作用相比差异无显著性.用1.2×10-6mol/LNA孵育标本后加入L-Arg, 各浓度的L-Arg与单独L-Arg组相比差别有显著性(P<0.001).分别用一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂L- NNA,可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ,α肾上腺素能受体阻断剂酚妥拉明均使NO对肌条收缩幅度抑制效应明显减弱,与对照组比较有显著性差异(P<0.001). 结论:L-Arg经NOS催化生成NO,NO与sGC结合, 激活了NO的下游途径,从而抑制了十二指肠肌收缩. 而NA可以增强NO的抑制效应,可能是通过α受体直接或间接影响了NOS的活性或者NO受体后机制.

β-肾上腺素能受体在NO抑制小鼠回肠自主收缩中的作用

目的:观察一氧化氮(nitric oxide,NO)供体左旋精氨酸(L-argnine,L-Arg)对小鼠回肠自主收缩幅度的影响,探讨β-肾上腺素能受体在NO抑制小鼠回肠自主收缩中的作用。方法:应用张力换能器记录标本自主收缩的方法,以回肠肌条自主收缩幅度变化为指标,观察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂L-NNA,可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)抑制剂ODQ(1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-α]quinoxalin-1-one),β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)和拮抗剂普萘洛尔(Propranolol)对NO作用的影响。结果:①L-Arg抑制小鼠回肠自主收缩幅度,呈浓度依赖性。②L-NNA(3×10-4mol/L),ODQ(3×10-4mol/L)均减弱L-Arg的抑制效应。③Propranolol(3×10-6mol/L)明显减弱L-Arg的抑制效应。④ISO(1×10-7mol/L)明显增强L-Arg的抑制效应。而Propranolol(3×10-6mol/L)和ISO(1×10-7mol/L)孵育组,L-Arg的抑制作用无明显变化。结论:L-Arg经NOS催化生成NO后经cGMP途径发挥对小鼠回肠自主收缩的抑制作用,β-受体途径也部分参与了NO的作用过程。

一个小麦低分子量谷蛋白基因的分离

以新疆小麦日喀则基因组DNA为模板,采用G lu-D 3位点特异引物进行PCR扩增。PCR产物插入pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α,获得阳性克隆。经测序发现该插入片段长度1 287 bp,包括了部分启动子序列和完整的编码序列。编码序列推导的蛋白质含有8个半胱氨酸残基,属于6类LMW-G S中的T ypeⅠ类,为以后这类基因的功能研究提供了基因材料。

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。

杂交后代中转基因小麦外源1Ax1基因的遗传

高分子量麦谷蛋白亚基1Ax1基因是决定小麦加工品质的主效基因之一,在小麦胚乳中增加1Ax1基因的表达量可以提高其加工品质,这对于小麦的品质改良具有重要意义。采用外源1Ax1基因超量表达的转基因小麦‘B102-1-2’为父本,常规小麦品种‘鄂麦12’和‘川89-107’为母本进行杂交试验。采用SDS-PAGE技术检测并分析各组合亲本、F1代、F2代的HMW-GS组成,从而研究转基因小麦‘B102-1-2’中外源品质基因1Ax1表达的遗传规律。研究结果表明:外源基因有效地整合进入主栽小麦的基因组中,并且正确表达,在F2代中表现出15∶1的分离比,遵循孟德尔遗传模式,这对于杂交育种策略的选择制订具有指导意义。

小鼠十二指肠运动中NO对NA作用的影响及机制

目的观察去甲肾上腺素(noradrenaline ,NA)对离体小鼠十二指肠肌条收缩幅度及一氧化氮(nitricoxide ,NO)对NA作用的影响;探讨NO和NA之间的关系及影响机制。方法用器官浴槽孵育离体小鼠十二指肠肌条,以肌张力收缩幅度抑制比为指标观察NA对肌条收缩幅度及NO对NA作用的影响。结果NA对肌条的收缩幅度有明显的抑制作用,在浓度1.2×10 -4～1.2×10 -8mol/L范围内,呈剂量-效应关系,其中1.2×10 -8mol/L组与对照组之间无显著性差异(P >0 .0 5 )。L Arg对肌条的收缩幅度有明显的抑制作用,在浓度2×10 -2 ～2×10 -6mol/L范围内,呈剂量-效应关系。除2×10 -6mol/L组外,其余各浓度的L Arg与对照组均有显著性差异(P <0 .0 0 1)。用无反应剂量2×10 -6和2×10 -3 mol/L的L Arg孵育标本后加入NA ,浓度为1.2×10 -5,1.2×10 -6,1.2×10 -7,1.2×10 -8mol/L的NA对肌条收缩幅度的抑制作用明显增强,与单独NA组的作用相比差异有显著性(P <0 .0 0 1) ;而1.2×10 -4mol/LNA组与单独NA组的作用相比差异无显著性(P >0 .0 5 )。分别用一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂L NNA、可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)抑制剂ODQ、α肾上腺素能受体阻断剂酚妥拉明(phentolamine)均使NA对肌条收缩幅度抑制效应明显减弱,与对照组比较有显著性差异(P <0 .0

C反应蛋白激活原纤毛抑制颅骨成骨细胞的增殖和分化

目的研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖及成骨分化的影响。方法取SD乳鼠颅骨组织用胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅰ消化得到原代ROB,随后将ROB用α-MEM培养基培养,传代3次后用于后续实验。在对照组和5 mg/mL CRP的处理组中,成骨分化培养基诱导3 d进行免疫荧光检测两组Ki-67和acetylated-α-tubulin和γ-tubulin表达情况;同时,蛋白质印迹分析osteopontin(OPN)、alkaline phosphatase(ALP)、acetylated-α-tubulin和γ-tubulin的表达;成骨分化培养基诱导21 d茜素红染色检测成骨基质矿化结节量。结果免疫荧光显示,5 mg/mL CRP抑制成骨细胞增殖,与对照组差异有统计学意义(P<0.001);蛋白质免疫印迹和茜素红染色显示,处理组OPN和ALP表达降低(P<0.01),矿化结节生成数量减少(P<0.001),与对照组比较差异均有统计学意义;免疫荧光结果显示,细胞原纤毛长度增加(P<0.001),免疫印迹结果显示acetylated-α-tubulin和γ-tubulin蛋白的表达均升高(P<0.001)。结论5 mg/mL CRP显著抑制ROB增殖与成骨分化矿化并且显著激活细胞原纤毛。CRP为炎症因子典型代表,这些数据表明炎症因子激活细胞原纤毛发挥其抑制成骨细胞的增殖与分化作用,提示抑制原纤毛或阻断炎症因子的释放可以治疗炎症引起的骨丢失疾病。

过表达Bmi-1基因对乳腺癌细胞株BT474侵袭转移能力的影响

目的建立过表达Bmi-1的乳腺癌稳定细胞株,检测过表达Bmi-1对该肿瘤细胞株侵袭转移能力的影响,探讨Bmi-1与乳腺癌转移的相关性。方法根据GenBank中人源Bmi-1的mRNA序列,设计引物,构建Bmi-1真核表达载体GV144-Bmi-1,将其转染乳腺癌细胞株BT474,G418筛选建立过表达Bmi-1的稳定细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot检测Bmi-1的mRNA和蛋白表达水平,Matrigel和Transwell侵袭小室模型检测转染和未转染BT474细胞体外侵袭和转移能力的变化,荧光定量PCR和Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的变化。结果成功构建人源Bmi-1真核表达载体GV144-Bmi-1,转染BT474细胞后,获得稳定转染细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,与空载体组相比,实验组Bmi-1的mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05)。Bmi-1过表达后,迁移能力明显增强、穿膜细胞数明显增多,MMP-2、MM-9 mRNA和蛋白表达水平显著增强(P<0.05)。结论过表达Bmi-1稳定细胞株构建成功,Bmi-1表达上调可显著提高乳腺癌细胞的体外侵袭转移能力。