鱼藤酮对SD大鼠脑组织神经元损伤的初步研究

目的通过对鱼藤酮导致慢性中毒SD大鼠脑组织标本的病理学检测,探讨鱼藤酮损伤脑神经元的作用机制。方法将20只雄性SD大鼠随机分为两组,实验组:1.5 mg/(kg·d)的鱼藤酮颈背部皮下注射8周,共10只;对照组:相同体积的葵花油颈背部皮下注射8周,共10只。实验中观察各组大鼠的一般情况并每周进行行为学测试及体重的测量。选取实验组全部存活的SD大鼠脑组织标本,共6个;在对照组中随机选取6个脑组织标本。随后进行HE染色,并用显微镜观察组织的病理变化。结果实验结束时,实验组大鼠共死亡4只,对照组无死亡现象。实验组大鼠在实验中表现出较为明显的毛色泛黄、反应迟钝、精神萎靡、活动减少、进食缓慢等中毒症状。在体重增长速度上与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在行为学上,实验组大鼠在网格实验中表现出了较为明显的行为学异常,第7、8周时两组大鼠移动的潜伏时间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠脑病理学检测提示实验组大鼠脑干区可见神经元数目减少、核固缩、变性等改变。黑质致密部多巴胺(dopanine,DA)神经元变性。对照组大鼠未见明显异常。结论鱼藤酮导致慢性中毒的SD大鼠脑组织神经元发生损伤,并出现神经系统相关的行为学表现,推测鱼藤酮造成线粒体损伤是导致神经元变性坏死的主要原因。

构建SD大鼠鱼藤酮中毒模型及其线粒体DNA突变的初步探索

目的构建SD大鼠鱼藤酮慢性中毒模型,同时对SD大鼠组织标本（脑组织和肝脏）进行线粒体DNA突变的初步探索,为后续实验提供线索。方法将75只雄性SD鼠随机分为三组,实验组：0.5 mg/（kg·d）鱼藤酮皮下注射4~8周,共45只;空白组：不予任何特殊处理4~8周,共15只;对照组：相同体积的二甲基亚砜（DMSO）皮下注射4~8周,共15只。其中实验组随机分为1、2、3小组,每小组15只;空白组和对照组也分别分为1、2、3小组,每小组5只。每组内相应的1、2、3小组分别在实验的第4、6、8周处死老鼠并留取相应的组织标本（中脑组织和肝脏）,存储于-80℃冰箱中待用。在实验组的每个小组内分别随机选取3对组织标本,共9对;在空白组和对照组的每个小组内分别随机选取1对组织标本,共6对。随后进行组织DNA提取,采用2对引物进行长PCR并将PCR产物进行凝胶电泳分析,同时设计并利用线粒体DNA引物,用一代测序的方法进行线粒体全基因组测序。实验中观察各组大鼠的一般情况并进行行为学测试。结果1）实验组大鼠在实验中表现出较为明显的中毒症状。在体重增长速度上与对照组和空白组存在明显差异（P〈0.05）。在行为学上,实验组大鼠亦表现出了较为明显的行为学异常（P〈0.05）。2）大鼠脑以及肝脏组织的长PCR凝胶电泳结果未发现明显的异常条带;所有测序突变（缺失、插入、点突变）均为大鼠固有突变。结论 0.5 mg/（kg·d）鱼藤酮皮下注射4~8周可导致SD大鼠鱼藤酮慢性中毒。SD幼鼠的选择、鱼藤酮剂量及作用时间、一代测序等多种因素可能是导致本次实验未检测到有意义的线粒体DNA突变的原因。因此,后续实验应做相应改进。

一个核黄素反应型多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症家系的基因突变分析

目的对1例误诊为原发性肉碱缺乏症（primarycarnitinedeficiency，PCD）的核黄素反应型多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（riboflavinresponsive-multipleacyl-CoAdehydrogenasedeficiency，RR-MADD）患儿及父母进行基因突变分析，以确定患儿的致病基因突变及误诊的原因。方法分析l例误诊为原发性肉碱缺乏症并用肉碱治疗7年的RR-MADD患儿的临床表型和腓肠肌活检的电镜检查特点，对患儿及父母进行电子转运黄素蛋白脱氢酶（electron transfer flavoprotein dehydrogenase，ETFDH）基因及肉碱转运蛋白基因（SLC22A5）进行突变检测。结果患儿肌肉活检的电镜观察显示大量脂质沉积。基因测序结果显示患儿的ETFDH基因第3外显子存在c．250G〉A和c．380T〉C复合杂合突变，患儿的父母分别为c．380T〉C和c．250G〉A的杂合突变携带者。患儿SLC22A5的基因测序未发现致病突变。患儿经基因确诊后同时补充肉碱与大剂量核黄素，病情得到改善。结论ETFDH基因第3外显子c．250G〉A突变（p．Ala84Thr）是我国南方人群中的1个突变热点，而c．380T〉C突变（p．Leu127Pro）在我国人群中罕有报道。该误诊提示诊断性治疗效果不能替代基因检测。单纯补充肉碱治疗RR-MADD可控制病情达7年，其原因有待于进一步探讨。