基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法的建立和性能评估

目的:通过噬菌体展示技术制备抗人IgE纳米抗体,将其用于磁微粒化学发光平台建立一种猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法。方法:在WHO/IUIS过敏原数据库中检索猫致敏蛋白信息,合成序列后在原核表达系统中表达和纯化猫皮屑致敏蛋白Fel d 1。使用人源IgE免疫新疆单峰驼提取淋巴细胞中的RNA建立噬菌体展示纳米抗体库,分析库容、多样性和插入率,通过筛选和鉴定获得抗人IgE纳米抗体。使用重组过敏原偶联磁微粒和吖啶酯标记纳米抗体,建立磁微粒化学法猫皮屑特异性IgE抗体检测方法。结果:噬菌体展示库的库容为1.88×108 cfu/ml,插入率为93.6%,纳米抗体纯度>95%。检测方法的线性范围为0.1~100 U/ml,与ImmunoCAP检测系统临床对比有较好的一致性。结论:成功建立了基于纳米抗体的猫皮屑特异性IgE抗体超敏检测方法,为猫过敏性疾病辅助诊断提供了技术基础。

牛冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39)。结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障。

牛冠状病毒S蛋白抗原表位基因的串联表达及抗血清制备

为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。

A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达及多克隆抗体的制备

为构建A型口蹄疫病毒多肽抗原表位的原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术将不同株的A型口蹄疫病毒抗原表位A-A10-61-VP1(第141～160位氨基酸)、A-A10-61-VP1(第200～212位氨基酸)、A22Iraq-VP1(第136～164位氨基酸)串联,在其间引入合适的linker序列,重组得到pET-28a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。成功构建了A型口蹄疫病毒抗原表位原核表达载体,获得高纯度重组蛋白和含A型口蹄疫病毒抗体的兔抗血清,为A型口蹄疫病毒诊断试剂盒的研发和A型口蹄疫病毒表位多肽疫苗的研究奠定基础。

牛肠道病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）是2011年在我国部分牛场新发现的一种消化道病毒病病原,因此亟需建立针对BEV快速、有效的检测方法。本研究根据BEV 3D基因保守序列,设计并合成一对特异性引物,建立了检测BEV的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法。该方法与引起牛的病毒性腹泻的其它几种牛的病毒均无交叉反应,检出敏感度达7.13×10^1拷贝/μL,比常规RT-PCR检测方法高10倍。应用该方法检测了3个规模化奶牛场送检的41份奶牛腹泻样本和3份气溶胶样本,腹泻样品阳性检出率为39.02%（16/41）;3份气溶胶样本均为阳性,表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量临床样本,本方法为BEV的早期快速诊断和定量分析提供了技术支撑。