反相高效液相色谱法测定血清中γ-氨基丁酸

建立一种高灵敏度的氯甲酸芴甲酯柱前衍生荧光检测反相高效液相色谱法测定血清中γ氨基丁酸的方法．内标为己氨酸，固定相为ＳｈｉｍＰａｃｋＣＬＣＯＤＳ（Ｍ），４６ｍｍ×１５０ｍｍ，填充料为５μｍ；流动相采用二元梯度洗脱，Ａ相为００５ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠缓冲液∶水∶四氢呋喃∶冰乙酸（２５０∶１００∶１５∶２２），Ｂ相为乙腈∶甲醇（４∶１）．系统研究了ｐＨ值、反应时间、离子强度及衍生化试剂用量对衍生化反应的影响，确定最佳反应条件和最佳色谱条件．方法的精密度为批内变异系数＜４６％，批间变异系数＜６１％；最低检出限（信噪比＝２）为３１ｎｍｏｌ／Ｌ；线性范围为５０～１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，γ２＝０９９９２；平均回收率为９７１％．

一种新的氨基酸测定衍生化方法

采用２，４二硝基氟苯作为衍生化试剂，１６种常见人体生理性氨基酸为分析对象，区带毛细管电泳为分离模式，建立一种新的氨基酸衍生化方法。系统研究了反应时间、反应温度和ｐＨ值对衍生化反应的影响。同时观察了４℃和２５℃室温下衍生化产物的稳定性情况，结果发现，无论是在４℃冰箱，还是在２５℃室温下，氨基酸衍生化产物保存５天，紫外吸收值无明显改变。方法的性能指标测定表明，该法的线性在１０～７００μｍｏ１／Ｌ范围内良好（γ在０．９６４～０．９９５之间）。最低检测限（Ｓ／Ｎ＝２）为２．５～７．９μｍｏｌ／Ｌ。测得平均回收率在８６．３～１０７．４％之间。该法具有衍生化反应操作简便、灵敏度高、稳定性好、线性及回收率佳等特点，不仅可用于氨基酸的衍生化反应，而且同样适合于其它含有氨基的生物活性物质的衍生化反应。

毛细管电泳测定微量氨基酸柱上样品堆积法研究

目的建立一种柱上样品堆积法测定微量氨基酸的方法。方法分别用运行缓冲液或用水和乙腈重组经萃取吹干的样品 ,压力法进样 5、2 5和 5 0s,高效毛细管电泳法定量分析 ,观察用不同溶剂重组对柱上样品堆积效果的影响。结果该法提高微量氨基酸检测灵敏度 10 0倍并保持柱效不变。结论用水和乙腈 (1∶1)作溶剂重组残留样品的方法获得最佳的柱上堆积效果。

上柱前样品萃取与浓缩技术在毛细管电泳法测定微量氨基酸中的应用

目的 建立一种上柱前样品萃取与浓缩技术测定生物样品中微量氨基酸的方法。方法 氨基酸与2 ,4 二硝基氟苯衍生化反应完成后 ,用 10ml叔丁基甲醚抽提 2次 ,每次 5ml,以除去多余衍生化试剂。然后用 6mol/L盐酸 2滴酸化 ,再用 6ml乙酸乙酯萃取两次 ,每次 3ml。最后合并上层萃取液 ,5 0°C水浴吹干 ,剩下含氨基酸的残留物用水和乙腈重组 ,用毛细管电泳法分析定量。结果 本法具有操作简单、萃取效率高的特点 ,平均萃取产率可达 99.3%。若用水和乙腈重组残留物至原来体积的十分之一 ,则柱前浓缩效果可达 10倍。结论 柱前萃取和浓缩技术操作简单 。

高效毛细管电泳分离手性氨基酸及D-氨基酸与老年前期痴呆关系的研究(综述)

高效毛细管电泳分离手性氨基酸及Ｄ－氨基酸与老年前期痴呆关系的研究（综述）沈佐君，孙曾培，杨树德（卫生部临床检验中心，卫生部北京医院，北京１００７３０）１高效毛细管电泳简介高效毛细管电泳（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐ...

高效毛细管电泳技术及其在医学检验中的应用

高效毛细管电泳是90年代最重要的分离分析手段之一,当今分析化学和分析生物化学的公认前沿。该技术十年前首先由Mikkers等采用,随后由Jor-genson和Lukacs进一步发展,现已在生物工程、医药、环保、食品检验及生命科学和化学很多其他领域显示了极其重要的应用前景,是人类进入纳米时代一种有重要潜在价值的手段。 高效毛细管电泳主要由5个部分组成,即毛细管柱、进样系统、高压系统、检测系统和数据收集系统。 与通常分析方法相比,高效毛细管电泳有很多优点,如分析速度快、准确,操作简便,灵敏度高,分析成本低等。其中最显著的特点是该技术分析范围广泛,从小分子或离子到生物大分子均可分析。到目前为止,高效毛细管电泳可以分成7种分离模式:(1)毛细管区带电泳,(2)胶束电动色谱,(3)毛细管凝胶电泳,(4)毛细管等电聚焦,(5)毛细管等速电泳,(6)毛细管电色谱,(7)亲和毛细管电泳。 高效毛细管电泳已开始对医学检验产生显著的影响,该技术不仅用于常规项目的分析,而且用于某些特殊项目的检验。其自动化、快速及高效分离的特性使其开始替代某些繁琐的常规方法和作为高效液相色谱的补充。 本文简要回顾高效毛细管电泳的发展史,仪器结构、特点,分离模式及目前在医学检验中的应用情况,

十种血红蛋白检测仪的精密度和线性范围的评价

选用性能可靠的Hb仪器,是保证其检测质量的必备条件。所用仪器种类繁多,归纳起来一般可分三类:(1)用分光光度计比色测定;(2)Hb专用机;(3)自动血细胞计数仪。为了评价目前常见的Hb仪器性能,我们根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS;National Committee

高效毛细管电泳技术及其临床应用进展

高效毛细管电泳(High Perfor-mance Capillary Electrophoresis,ⅡPCE)是在传统电泳与色谱相结合的基础上发展起来的一种高效分离技术。自1967年Hierten首先提出在高电场下用毛细管作自由溶液区带电泳(CZE)。

多胺的测定方法及其临床应用

多胺(Polyamine,PA)是指三胺的精脒(Spermidine,Spd,又称亚精胺)和四胺的精胺(Spermine,Spm),习惯上人们往往将其前体物二胺的腐胺(Putrescine,Put)亦包括在多胺的范围内.它们都是一些小分子脂肪族非蛋白质含氮化合物,这些物质广泛地分布在原核和真核细胞体内.研究发现,多胺与细胞内DNA、RNA及蛋白质的合成有密切关系,在细胞生长分化活跃的组织内,它们的含量明显增高.

高效毛细管电泳仪在临床微生物学检验中的应用

高效毛细管电泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）技术是一种新型高效液相分离技术，具有快速、高效、高灵敏度、重复性好、易定量、非同位素操作、可实时监测及全自动化等优点，广泛应用于化学、生物学、医学、环境卫生等各个方面，尤其是用于生物医学，如甄别人类遗传性基因缺陷、对基因进行定量分析、微生物学和病毒学分析、法医分析、基因治疗等。目前，在临床检验中HPCE主要用于检测糖、蛋白质、核酸等。

茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术

采用胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸,以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,建立茶氨酸定量的新方法。运行缓冲液为pH9.8的0.03 mol/L四硼酸钠缓冲液体系,分离电压为28kV,分离温度为17℃,在360 nm下进行检测。研究了不同pH、反应时间、反应温度、缓冲液浓度对衍生化反应的影响,确立了衍生化反应的最佳条件。证实了4℃和25℃环境下衍生化产物可以稳定保存5天。测定了茶氨酸衍生化方法的性能指标:线性范围为0.2～5 mmol/L(r2=0.993),最低检测限为0.05 mmol/L。

淫羊藿苷逆转耐甲氨蝶呤肺癌A549细胞转移表型

目的:研究中药淫羊藿苷(icariin,ICA)作用甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)耐药肺癌A549细胞后对细胞转移表型的影响,初步探讨ICA逆转A549/MTX耐药细胞转移表型的作用机制及对肺癌的治疗价值。方法:采用MTT法检测ICA对A549/MTX耐药细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)。采用双层软琼脂克隆形成实验检测A549/MTX组和A549/MTX+ICA组细胞的克隆形成率,并观察其集落形态。细胞划痕实验检测A549/MTX组和A549/MTX+ICA组细胞的迁移能力。Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:MTT结果显示,无毒剂量的ICA与MTX联合应用后A549/MTX细胞的IC50值为35.50±1.85μmol/L,比单独应用MTX(同等剂量)后A549/MTX细胞的IC50值(52.17±2.25μmol/L)有了一定程度的下降。软琼脂实验发现,A549/MTX+ICA组细胞克隆形成率为0.94±0.09,小于A549/MTX组细胞的1.56±1.07(P<0.05)。划痕实验显示,72 h后A549/MTX组细胞的迁移能力大于A549/MTX+ICA组细胞(P<0.05)。Transwell实验显示,A549/MTX组细胞的穿膜细胞数明显多于A549/MTX+ICA组细胞(P<0.05),说明A549/MTX+ICA组细胞的侵袭浸润能力小于A549/MTX组细胞。结论:中药ICA具有逆转A549/MTX耐药细胞转移表型的作用。

氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株的建立及其生物学特征

目的诱导并建立耐氨甲蝶呤对映体的A549细胞株并观察耐药细胞系(L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549)的生物学特性。方法以MTX对映体为诱导剂,采用浓度递增结合低剂量持续诱导方法诱导A549细胞株,建立MTX不同对映体耐药细胞系;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法绘制细胞生长曲线;MTT法检测耐药细胞株的耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期和细胞的分裂增殖能力。结果L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药指数分别为6.0的和20.2。倒置相差显微镜观察细胞形态发生了改变;细胞生长曲线显示D-(-)-MTX/A549的增殖略慢于亲本细胞,而L-(+)-MTX/A549的增殖最慢;流式细胞仪检测细胞周期结果显示L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药细胞株S期细胞数量减少(P<0.05),G0/G1期细胞增多(P<0.05);CFSE检测A549、L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549的MFI分别为(6.08±0.55)、(7.72±0.30)、(6.90±0.18)。两对映体细胞株间有明显手性差异。结论本研究建立了MTX两种对映体耐药细胞株,为进一步研究其耐药机制提供了一种实验模型。

腹泻型肠易激综合征患者肠道目标菌群的分析

目的研究腹泻型肠易激综合征(IBS-D)患者与正常对照者的肠道菌群差异。方法实时荧光定量PCR法检测50例IBS-D患者及25例正常对照者粪便中长双歧杆菌属、乳酸杆菌属、脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌和粪肠球菌属的数量,并对各组的目标菌群数量进行比较,计算肠道定值抗力,肠道定值抗力(CR)是指肠道内需氧的潜在致病菌群被肠道内源性厌氧菌抑制的能力,双歧杆菌数值与肠杆菌数值之比作为肠道微生物定值抗力的指标,即B/E值。结果与正常对照者比较,IBS-D患者粪便中大肠埃希菌、产气荚膜梭菌的数量明显增多(P<0.05),而乳酸及双歧杆菌属的数量明显减少(P<0.05),粪肠球菌、脆弱拟杆菌在两组之间比较差异无统计学意义。IBS-D患者B/E值<1,与正常对照者比较明显降低(P<0.05)。结论 IBS-D患者肠道菌群平衡被打破,表现为B/E值降低,且粪便中肠杆菌及产气荚膜梭菌数量增加,双歧杆菌、乳酸杆菌的数量明显减少。

甲氨蝶呤对映体诱导的肺癌A549耐药细胞株中VEGF及其受体表达差异的研究

目的:通过探讨甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)对映体耐药细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fac-tor,VEGF)及其受体表达的差异,以反映MTX对映体耐药细胞在肿瘤中血管形成能力的不同。方法:采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)技术分别检测D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组以及亲本细胞组中VEGF、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-1和VEGFR-2mRNA的表达水平;皮下接种裸鼠,成瘤后取瘤体切片,行CD34免疫组织化学检测,新生微血管密度(microvessel density,MVD)计数;采用双层软琼脂克隆形成实验检测D-(-)-MTX/A549组、L-(+)-MTX/A549组细胞的克隆形成率。结果:RFQ-PCR检测结果显示,D-(-)-MTX/A549组VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2Ct值/β-actinCt值分别为1.668±0.127、1.872±0.133和1.919±0.107,L-(+)-MTX/A549组的比值分别为2.035±0.185、2.221±0.157和2.255±0.140,亲本细胞组的比值为2.057±0.123、2.291±0.138和2.354±0.131;3种细胞植入裸鼠成瘤后切片免疫标记CD34统计MVD显示亲本细胞为3.29±1.11,L-(+)-MTX/A549细胞为8.00±2.14,D-(-)-MTX/A549细胞为57.88±13.87;软琼脂实验检测克隆形成率发现D-(-)-MTX/A549组为(0.625±0.088)%,L-(+)-MTX/A549组为(1.050±0.095)%,亲本细胞组为(1.250±0.248)%。研究结果显示D-(-)-MTX/A549组和L-(+)-MTX/A549组以及亲本细胞组之间差异均有统计学意义(P<0.05),而L-(+)-MTX/A549组与亲本细胞组之间则差异无统计学意义(P>0.05)。结论:D-(-)-MTX诱导肺腺癌A549耐药细胞在肿瘤血管形成上的能力大于L-(+)-MTX诱导的细胞。

临床氨甲蝶呤血药浓度监测及其制剂中对映体成分分析

目的 建立快速检测血清中氨甲蝶呤 (MTX)浓度的方法及其对映体在药品制剂中的拆分方案。方法 应用高效毛细管电泳技术 ,选用直径 75 μm、总长 6 0 cm,有效长度 5 0 .5 cm未包被的石英毛细管 ,以 75 mmol/ L的磷酸盐为电泳缓冲液 ,检测波长为 30 6 nm,在 2 5 k V电压下快速分离检测 MTX;另外利用手性包容剂—环糊精拆分了几种 MTX药物制剂中对映体。结果 MTX的出峰时间在 10分钟以内 ,线性范围在 1.1～ 110 0 .0μm ol/ L间 ,最低检出浓度为 0 .5 5μmol/ L ,回收率为 88.2 %～ 98.2 % ,批间精密度为 5 .4 % ,批内精密度为 4 .2 % ;另在在电泳缓冲液中添加了有机改性剂和环糊精后能将 MTX对映体完全拆分。结论 高效毛细管电泳法检测 MTX血药浓度具有快速、准确及成本低廉等特点 ,并可用于其手性对映体的拆分和分析。

高效毛细管电泳测定海马组织和脑脊液中氨基酸类神经递质

目的建立测定大鼠海马组织和人脑脊液中氨基酸类神经递质的高效毛细管电泳分析方法。方法用高效毛细管电泳技术,选用总长60 cm、有效长度50.5 cm、直径75μm熔融石英毛细管,在20 kV电压下快速分离4种氨基酸。以100 mmol/L硼酸-三羟甲基氨基甲烷（Tris）（1∶1,含1%异丙醇）为电泳缓冲液（pH值为10.35）,激光诱导荧光检测器进行检测,并对此方法进行方法学评价。同时检测45例患者脑脊液的氨基酸含量。结果谷氨酸（GLU）、天冬氨酸（ASP）、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（GLY）4种氨基酸能在15 min内分离,线性范围为1.0~100.0μmol/L,GLU、ASP、GABA、GLY最低检出限分别为10、23、18、15 nmol/L,4种氨基酸的批内精密度范围4.44%~9.72%,批间精密度范围6.96%~10.50%。4种氨基酸的回收率不低于88.1%。全面性大发作癫痫患者GLU、GLY、ASP含量显著高于对照组（P〈0.05）,而GABA较对照组差异无统计学意义;复杂部分性发作癫痫患者4种氨基酸含量较对照组显著增加（P〈0.05）。结论高效毛细管电泳具有快速、灵敏、准确的特点,为临床和科研提供了一种有效的方法。

一种检测细菌性阴道病方法的建立及临床评价

目的评估一种国内自主建立利用唾液酸酶检测细菌性阴道病（BV）方法的临床应用价值。方法比色法探索研发试剂与酶标准品的最佳反应条件,包括底物溶液的pH值和反应的最适温度及时间。采用研发试剂、BV BLUE、临床现用国产试剂盒对临床标本进行检测,判断研发试剂的临床应用价值。结果研发试剂在pH值6.0-6.2、37℃10 min时与酶标准品达到最佳反应,与BV BLUE相比,检出限相同时研发试剂底物用量仅为BV BLUE的1/2.78。临床实验中,研发试剂与BV BLUE对BV的检测效果差异无统计学意义（P=1.000,Kappa=0.905）,符合率为96%。而国产试剂盒与BV BLUE对BV的检测效果差异有统计学意义（P=0.000,Kappa=0.362）,符合率为65%。结论研发试剂可以达到与BV BLUE相同的检出效果,其快速、方便、可信度高且成本较低,优于国内类似产品,更有利于在临床推广和使用。

中国临床实验室标本可接受性质量指标室间质量调查研究

目的分析中国临床实验室标本可接受性质量指标(QI)的现状并制定初步质量规范。方法使用基于Web的室间质量评价软件,收集从2015年~2017年(截至6月15日)参加"临床检验专业医疗质量控制指标"室间质评的实验室数据,包括2015年1次,2016年2次和2017年1次的标本类型错误率、标本容器错误率、标本采集量错误率和抗凝标本凝集率。用率和西格玛两种方式度量评价。采用各指标总体分布的P25和P75制定初步的高、中等和低性能规范。结果分别有5 346,7 593,5 950和6 874家实验室回报了有效数据。生化(除标本采集量错误率外)、免疫和微生物专业4项指标的P50达到6σ水平。临检专业除标本容器错误率外,其它指标的P50为4σ~6σ水平不等。连续3年的QI数据没有明显变化。以2017年第一次结果为依据制定初步质量规范,标本类型错误率的P25为0,P75为0.084 4%;标本容器错误率的P25为0,P75为0.047 6%;标本采集量错误率的P25为0,P75为0.114 2%;抗凝标本凝集率的P25为0,P75为0.0784%。结论大部分实验室生化、免疫和微生物4项指标表现良好,临检专业有待加强。实验室应加强信息系统建设,保证采集数据真实可靠,从而长期纵向监控实现质量改进。

氨甲蝶呤对映体获得性耐药A549细胞株二氢叶酸还原酶基因表达分析

目的研究氨甲蝶呤(MTX)对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药与二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达的关系。方法用浓度递增结合低剂量持续诱导法获得A549细胞对不同构型及不同浓度的MTX对映体的耐药细胞株,荧光定量PCR检测耐药细胞株中DHFR基因的相对含量。结果对两种不同对映体的获得性耐药存在差异,D型耐药细胞耐药指数高于L型;对映体各浓度耐药细胞间耐药指数也有差异。15μmol/L L型、D型MTX首次诱导耐药细胞的DHFR相对含量低于亲本细胞,对该浓度对映体耐药的各细胞组间没有差别(P>0.05)。35～45μmol/L浓度耐药细胞的DHFR相对含量增加,45μmol/L D型耐药细胞DHFR相对含量高于对应浓度L型耐药细胞,差异有显著性(P<0.05)。结论首次诱导MTX耐药以抑制DHFR基因为主。DHFR基因表达具有手性差异。DHFR基因的检测有望作为肿瘤治疗监测的指标。