双分离法记录Wistar大鼠神经元的全细胞电流

背景:细胞培养与通道电流记录是全细胞膜片钳实验的主要难点。目的:介绍一种简单可行的降低全细胞膜片钳实验方法,将细胞急性分离与电流的分离技术结合起来,以提高工作效率,缩短实验的时间,从根本上降低膜片钳实验的难度。方法:SPF级出生4～7d的wistar大鼠40只,雌雄不限。采用改良的急性分离的方法制备Wistar大鼠脑皮质细胞,将大鼠脑皮质切成400～600μm厚度的薄片,在人工脑脊液中通混合气静止1h,并通以氧气。将脑组织块放入含有16u/mL(typeX)和2u/mL(typeXIV)蛋白水解酶的人工脑脊液中,孵育60min,清除消化酶。在全细胞电压钳制模式下,保持电位-80mV,给予-60mV到60mV的去极化脉冲刺激,步阶为+10mV,刺激波宽160ms。记录到跨膜总电流,在全细胞电极液里面加入70mmol/LCsCl,70mmol/LCsF;在外液中先后加入11μmol/L阻断剂河豚毒素、30mmol/L的氯化四乙胺、1mmol/L的4-AP。分别记录内向钠电流,瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流,结果用clampfit分析处理。主要观察:①细胞的形态学观察。②全细胞电流的记录。③内向钠电流的记录。④外向钾电流的记录。结果与结论:细胞空间立体结构强,表面光滑,有完整的树突或者轴突,且细胞的活性可以在25℃室温下维持8～10h。在外液中加入1μmol/L的河豚毒素基本上可以阻断钠电流;30mmol/L的氯化四乙胺和1mmol/L的4-AP可以阻断外向钾电流。结果表明,改良的细胞急性分离方法细胞功能完好。通过电流分离技术,不改变细胞外液和电极液,仅需添加特异阻断剂,可记录到内向钠电流,瞬时外向钾电流以及延迟整流钾电流,较之传统方法可显著提高工作效率。

0.5 mT工频磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾离子通道和动作电位的影响

目的 研究与日常生活密切相关的0.5 mT工频磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元的影响.方法 采用急性分离的方法制备小鼠海马CA3区锥体神经元,用0.5 mT、50 Hz磁场对小鼠海马CA3区锥体神经元刺激30 min后,运用全细胞膜片钳技术研究其延迟整流钾通道电流,Ik和动作电位特性.结果 0.5 mT工频磁场照射小鼠海马CA3区锥体神经元30 min后,其电流密度减小,对照组和曝磁组最大电流密度分别为（171.05＋1.32）pA/pF、（139.65±2.37）pA/pF（n=12,P〈0.05）;对照组和曝磁组半数激活电压分别为（7.44±0.64）mV、（34.09＋6.48）mV（n=12,P〈0.05）;斜率因子分别为11.36±0.57、19.97±3.45（n=12,P〈0.05）;动作电位复极化时程APD90由（14.63±0.34）ms延长为（21.74±1.47）ms（n=12,P〈0.05）.结论 0.5 mT工频磁场可使小鼠海马CA3区锥体神经元延迟整流钾通道电流Ik减小,通道开放延迟,通道激活速度减慢,动作电位复极化时间延长.