玉屏风散对小鼠胸腺上皮细胞介导的皮肤淋巴细胞功能的影响

目的研究玉屏风散对BALB/c小鼠胸腺上皮细胞(TEC)及TEC介导的小鼠淋巴细胞功能的影响。方法分离BALB/c小鼠皮肤组织,给予不同浓度玉屏风散、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、及给予不同浓度玉屏风散的TEC培养皮肤组织3 d,实验分为对照组、玉屏风散低剂量组(YPF-L)、玉屏风散中剂量组(YPF-M)、玉屏风散高剂量组(YPF-H)、TSLP低剂量组(TSLP-L)、TSLP中剂量组(TSLP-M)、TSLP高剂量组(TSLP-H)、与TEC共培养组(TEC)、TEC共培养低剂量组(TEC-L)、与TEC共培养中剂量组(TEC-M)、与TEC共培养高剂量组(TEC-H),免疫组化法检测皮肤组织中CD3,CD4,CD8和TSLP的表达;分离小鼠脾淋巴细胞和胸腺细胞,MTT法检测玉屏风散对脾淋巴细胞、胸腺细胞和TEC增殖的影响(24,48,72 h);qPCR检测玉屏风散对TEC中TSLP、信号传导及转录激活因子3(STAT3)、白细胞介素6(IL-6)、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA水平变化;ELISA检测玉屏风散对TEC中IL-7水平的影响;流式细胞术检测玉屏风散对TEC与脾淋巴细胞和胸腺上皮细胞共培养2 d后两细胞中CD3,CD4,CD8和CD45阳性细胞的变化。结果免疫组化结果显示,与对照组相比,YPF-L,YPF-M和YPF-H组皮肤组织内CD3,CD4,CD8阳性细胞数量无明显变化,TSLP未见表达。TEC,TEC-L,TEC-M和TEC-H组皮肤组织内CD3,CD4,CD8阳性细胞数量增加,且给药组较明显,TSLP未见表达。TSLP-L,TSLP-M和TSLP-H组皮肤组织内CD3,CD4,CD8阳性细胞数量无明显变化,TSLP表达增强。说明玉屏风散可通过调节TEC提高皮肤免疫功能,且与TSLP无明显关系;与对照组相比,玉屏风散对TEC的增殖无明显影响,48 h时玉屏风散12.5,25,50,100,200 mg·L^-1对脾淋巴细胞和胸腺细胞具有一定的增殖作用(P<0.05);与对照组相比,不同浓度玉屏风散均能够显著下调TEC中TSLP,STAT3,IL-6,IL-10,IL-12,IL-17和TNF-αmRNA水平(P<0.01),显著上调IL-7 mRNA水平(P<0.01);ELISA结果显示,玉屏散低、中、高剂量组TEC中IL-7水平分别为(0.18±0.04,0.21±0.03,0.23±0.07)mg·L^-1,与对照组(0.15±0.02)mg·L^-1相比,低剂量组上调了TEC中IL-7的水平(P<0.05),中高剂量组显著上调了TEC中IL-7的水平(P<0.01);与脾淋巴细胞及胸腺细胞单独培养组、TEC和脾淋巴细胞及胸腺细胞共培养组相比,玉屏风散提高了两细胞中CD3,CD4,CD8阳性细胞数量(P<0.05),对CD45阳性细胞无明显影响。结论玉屏风散可通过上调胸腺上皮细胞IL-7的水平,从而提高BALB/c小鼠皮肤淋巴细胞的数量及功能。

玉屏风散对小鼠胸腺上皮细胞介导的皮肤T淋巴细胞功能的影响

[目的]研究益气固表经典方玉屏风散(Yupingfeng Powder,YPF)对BALB/c小鼠胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)介导的小鼠皮肤T淋巴细胞功能的影响。[方法](1)离体器官培养法研究YPF对BALB/c小鼠表皮淋巴细胞的影响及TECs在该过程中的作用。分离BALB/c小鼠皮肤组织和原代TECs细胞,设对照组(正常培养皮肤组织),YFP低、中、高剂量组(皮肤组织予25、50、100μg·mL^-1YPF处理)、TEC共培养组(TECs与皮肤组织共培养)、TEC+YPF低、中、高剂量组(TECs与皮肤组织共培养,同时分别加入25、50、100μg·m L^-1YPF处理),以上各组培养72h后以免疫组化法检测皮肤组织中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的数量。(2)研究YPF对BALB/c小鼠胸腺细胞、脾细胞的影响及TECs在该过程中的作用。分离小鼠脾淋巴细胞和胸腺细胞,以噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法检测25、50、100μg·mL^-1YPF对脾淋巴细胞和胸腺细胞增殖的影响。再采用TECs分别与脾淋巴细胞或胸腺细胞共培养,以对照培养液或上述浓度YPF处理48h,流式细胞术检测脾淋巴细胞和胸腺细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+细胞比值的变化,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测脾淋巴细胞和胸腺细胞中γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)和IL-4的表达水平。(3)研究YPF对BALB/c小鼠TEC增殖及功能的影响。25、50、100μg·mL^-1YPF直接干预TECs 48h,MTT法检测YPF对TECs增殖的影响,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测TECs中胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)、信号传导及转录激活因子3 (signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-7、IL-12和IL-17 m RNA水平变化,ELISA检测TECs分泌IL-7的水平。[结果](1)与对照组比较,TECs与皮肤组织共培养后,皮肤中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量增加。YPF处理后增加更明显。(2)不同浓度YPF对脾淋巴细胞和胸腺细胞均有促增殖作用(P<0.01);与脾淋巴细胞、胸腺细胞单独培养组比较,脾淋巴细胞、胸腺细胞与TECs共培养,并采用不同剂量YPF处理后CD3+、CD4+、CD8+T细胞数均显著升高,其中脾淋巴细胞+TECs+高剂量YPF组和胸腺细胞+TECs+各剂量YPF组中CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.05,P<0.01);ELISA结果显示,TECs与脾淋巴细胞或胸腺细胞共培养后,采用不同剂量YPF处理,IFN-γ水平均升高,YPF中、高剂量组IL-2水平升高(P<0.05)。(3)不同浓度YPF处理能显著下调TECs中TSLP、STAT3、TNF-α、IL-12和IL-17mRNA水平,显著上调IL-7 mRNA水平(P<0.01),增加TECs分泌IL-7的水平(P<0.05,P<0.01)。[结论]YPF可增强TECs介导的皮肤T细胞数量增殖,并刺激IFN-γ等细胞因子分泌。YPF还能够促进脾淋巴细胞和胸腺细胞的增殖,增强其功能,并促进T细胞向Th1细胞分化,其机制可能与YPF能促进TECs分泌IL-7有关。本研究提示,YPF具有潜在的促进胸腺介导的皮肤T淋巴细胞免疫功能的作用。

何首乌苷对对乙酰氨基酚致豚鼠听力损伤的保护作用

目的 探究何首乌苷(2,3,5,4’-tetrahydroxy stilbene-2-Ο-β-D-glucoside,TSG)对对乙酰氨基酚(4-acetaminophen,APAP)致豚鼠听力损伤的保护作用。方法 采用APAP诱导豚鼠耳损伤,TSG处理后,测试豚鼠的听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)、畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustie emissions,DPOAE)等,判断听力损失情况,免疫荧光观察耳蜗毛细胞损伤情况,对豚鼠肝肾组织进行病理学观察,判断TSG对肝肾的毒性;以APAP致HEI-OC1听神经细胞损伤为耳损伤细胞研究,通过MTT法、细胞形态学观察、流式细胞仪检测细胞存活及凋亡情况,荧光定量PCR检测Birc5基因的表达。结果 与模型组相比,第14天时,豚鼠ABR听力阈值显著降低,DPOAE测试频率为2 kHz时差异更加显著(P<0.01),听觉惊跳反射显示在100 dB时惊跳反射幅值显著降低(P<0.05),间隙前脉冲抑制试验表明在10,40,50 ms时惊跳反射幅值降低;剥离豚鼠耳蜗,免疫荧光染色后观察毛细胞完整性,与模型组比较,TSG组外毛细胞排列整齐,细胞无缺失,内毛细胞排列基本整齐;病理学观察发现TSG具有一定的肝毒性而肾毒性不明显。细胞实验发现,APAP对HEI-OC1听神经细胞的半数抑制浓度为800μmol·L^(–1),10μmol·L^(–1 )TSG干预APAP诱导的细胞损伤时,凋亡率下降至16.0%,显著低于模型组(APAP)组的25.5%。APAP组HEI-OC1细胞Birc5表达水平明显下降,TSG处理可明显升高Birc5表达水平。结论 TSG 15 mg·kg^(–1)处理14 d可以对100 mg·kg^(–1)APAP诱导的豚鼠听力损失产生保护作用,该保护作用与TSG抑制APAP导致的听神经细胞凋亡及促进凋亡抑制因子Birc5的表达有关。

乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制研究

目的:探讨乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制。方法:①选用BALB/c小鼠,建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型。模型动物随机分为模型组、环磷酰胺(CTX,30 mg/kg)组和乳痈方低、中、高剂量(0.145,0.29,0.58 g/kg)组,每组4只。各组给予相应干预,连续20 d。末次给药后,采集小鼠胸腺、肺、脾、肿瘤、淋巴结组织,计算脏器指数和抑瘤率;观察肺表面结节情况,计算肺转移率。HE染色后光镜下观察胸腺形态学变化,免疫组化检测胸腺组织钙黏附蛋白E(E-cadherin)和波形纤维蛋白(Vimentin)的表达。②体外分离小鼠原代胸腺上皮细胞(TECs),通过转染SV40T基因构建永生化TECs(iTECs)并验证。采用不同浓度(0、25、50、100、200、400μg/ml)乳痈方提取液处理iTECs。细胞培养48 h后,MTT法检测细胞增殖率,结晶紫染色观察细胞增殖情况。将iTECs分为空白组、TGF-β1组(10 ng/ml TGF-β1)、乳痈方低剂量组(10 ng/ml TGF-β1+50μg/ml提取液)、乳痈方中剂量组(10 ng/ml TGF-β1+100μg/ml提取液)、乳痈方高剂量组(10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml提取液)。先加入TGF-β1诱导48 h后,再给予相应浓度的乳痈方提取液干预24 h。免疫荧光和PCR检测细胞表型标志物E-cadherin、Vimentin、α-微管蛋白(α-tubulin)及相关转录因子Zeb 1、Snail 1的表达水平。建立Smad转染的iTECs,荧光素酶报告基因检测乳痈方对TGF-β1诱导的转染iTECs细胞Smad通路活化的影响。结果:①与模型组相比,乳痈方低、中、高剂量组的肿瘤指数均显著降低(P<0.05),抑瘤率分别为33.45%、31.43%和6.49%;肺转移总数以及直径>2 mm转移灶数均明显减少(P<0.05,P<0.01),肺转移率分别为75%、75%和100%。HE染色观察显示,模型组小鼠胸腺组织皮质和髄质交界模糊,细胞排列紊乱,皮质萎缩;乳痈方各剂量组小鼠的胸腺组织皮质区和髄质边界较明显,皮质区细胞总数较模型组显著增多(P<0.05,P<0.01),髄质区细胞总数较模型组显著减少(P<0.05,P<0.01)。免疫组化检测显示,乳痈方干预后,模型小鼠胸腺组织上皮细胞标记物E-cadherin阳性表达增多,间质细胞标记物Vimentin阳性表达减少。②成功构建iTECs,iTECs与TECs形态相似,且高表达SV40基因和CK5蛋白。MTT检测和结晶紫染色观察显示,100、200、400μg/ml乳痈方干预可促进iTECs增殖(P<0.01)。③TGF-β1诱导后,iTECs逐渐变为长梭形,E-cadherin表达和mRNA水平降低(P<0.05),Vimentin表达和mRNA水平上调(P<0.05),且相关基因Snail 1和Zeb 1的mRNA水平显著升高(P<0.01)。乳痈方干预可抑制TGF-β1诱导的细胞形态向长梭形变化,上调E-cadherin表达和mRNA水平(P<0.01),下调Vimentin表达和mRNA水平(P<0.05,P<0.01),且显著降低Snail 1和Zeb 1的mRNA水平(P<0.01)。④TGF-β1诱导可引起iTECs细胞Smad mRNA水平明显上调(P<0.01),不同剂量乳痈方作用均可使Smad mRNA水平显著下调(P<0.01),且低剂量组的信号通路活化程度较TGF-β1组明显降低(P<0.05)。结论:乳痈方可有效逆转乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞的表型变化,其作用机制与抑制TGF-β1/Smad通路有关。