甘蔗与蔗茅杂交亲本及后代材料的抗旱性鉴定

研究旨在筛选出优良抗旱育种材料,为今后甘蔗抗旱育种和抗旱栽培技术提供重要的理论依据。采用盆栽干旱处理,测定蔗茅野生种无性系、甘蔗栽培品种(系)及其杂交后代共12份材料苗期与抗旱相关的8项生理生化指标,利用极点排序法对供试材料的抗旱性进行了综合评价。结果表明:干旱胁迫下,12份供试材料的Pro、MDA、SS及PMP均呈上升趋势,SP、Chl和SOD活性呈下降趋势,CAT活性有升有降。极点排序法分析表明,12个供试材料的抗旱强弱为:’蔗茅99-2’>’蔗茅99-1’>’蔗茅99-4’>’蔗茅I91-8’>’蔗茅99-3’>’蔗茅90-29’>’滇蔗01-58’>’滇蔗04-14’>’滇蔗02-39’>’蔗茅II91-2’>’新台糖10’>’崖城89-9’,说明蔗茅优质抗旱性状可以通过基因渗透方式传递给后代。在苗期干旱胁迫下’,蔗茅99-2’在渗透调节等方面表现出积极的生理响应。

甘蔗近缘野生种蔗茅EfGRAS基因克隆及表达分析

为深入挖掘甘蔗品种的抗旱性能,本研究挑选甘蔗品种中参与调控抗旱机制的主要转录因子GRAS的基因进行表达分析。从转录组数据库中调取GRAS转录因子基因序列信息,采用RACE-PCR和qRT-PCR技术从‘蔗茅99-2’中克隆得到1个GRAS基因,将其命名为EfGRAS(GenBank登录号MT499789),并对其进行生物信息学分析与干旱胁迫表达分析。结果表明,EfGRAS基因编码547个氨基酸,CDS全长1644 bp,该蛋白的分子式为C2645H4149N747O816S21,相对分子质量为60.14 kDa,不稳定系数为54.85,脂肪系数为84.37,GRAVY值为‒0.293,是一类不稳定蛋白和亲水蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲,与高粱亲缘关系最近;qRT-PCR分析显示,受到干旱胁迫后,‘蔗茅99-2’中基因表达量相比于对照组上调约57.6倍,‘滇蔗01-58’中基因表达量相比于对照上调约27.4倍,‘崖城89-9’中基因表达量相比于对照组上调倍数较低。本研究结果为进一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理论基础。

基于转录组测序的斑茅SaWRKY基因克隆与分析

本研究以斑茅(Saccharum arundinaceum)野生种中抗旱性较强的‘斑茅90-14’和抗旱性较弱的‘斑茅82-53’为供试材料,利用转录组测序技术构建干旱处理后的斑茅差异基因表达谱,并筛选出了1个上调表达的WRKY基因。通过荧光定量PCR检测该WRKY转录因子基因在2个供试斑茅材料伸长期的表达模式,结果表明该基因均受干旱诱导上调。利用转录组数据得到的序列片段,结合RT-PCR技术克隆到该基因,命名为SaWRKY,NCBI登录号为MH745130.1;对其进行同源序列比对和系统进化树分析,结果表明:该基因总长度为1001 bp,其中蛋白质编码区(CDS)全长810 bp,编码269个氨基酸;该基因与禾本科同源基因整体相似度高。生物信息学分析结果显示,SaWRKY蛋白分子式为C1218H1936N378O382S12,分子量为28.37 kD,理论等电点为9.12,不稳定系数55.67,预测为不稳定蛋白。疏水性/亲水性预测表明SaWRKY蛋白为亲水蛋白。二级结构预测显示,SaWRKY氨基酸组成包含α螺旋(16.73%)、延伸主链(14.87%)、β转角(4.46%)和无规则卷曲(63.94%),属于不规则结构。本研究结果为进一步阐明SaWRKY基因在斑茅中响应干旱胁迫的生物学功能提供了理论依据。

甘蔗赤腐病内生拮抗菌YC89的筛选及鉴定

【目的】筛选防治甘蔗赤腐病(sugarcane red rot)的生防菌株。【方法】实验以前期分离获得的甘蔗内生细菌为目标菌,以甘蔗赤腐病的病原真菌镰孢炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.)为指示菌,采用平板对峙法筛选对该病菌有较强抑制作用的菌株,然后通过琼脂扩散法测定菌株代谢产物对抑菌活性的影响,并对具有较好拮抗效果的高效菌株进行抑菌广谱性分析并对其进行鉴定。最后通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrA序列分析对高效菌株YC89进行鉴定。【结果】经初筛筛选到抑菌带均大于1.60 cm的5株拮抗细菌,其中X22、W2、YC89抑菌带均高达1.87 cm。对初筛得到的5株内生菌进行复筛,结果所示菌株YC89、H1、X22、W2、YT93对镰孢炭疽菌的抑菌率都在75%以上,其中菌株YC89对该病菌的抑菌效果最好,其抑菌率为78%。菌株YC89的发酵液、上清液、过滤液及粗蛋白提取液对镰孢炭疽菌的生长有较强的抑制作用,且菌株YC89对玉米大斑病、甘蔗梢腐病、草莓灰霉病等7种病原菌也有较好的抑制效果。通过菌株鉴定结果,初步将YC89菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。【结论】菌株YC89对镰孢炭疽菌具有较好的抑制效果,表明其对甘蔗赤腐病的生物防治具有较大的应用潜力。

蔗茅野生种ErDREB1A基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅野生资源,培育耐寒转基因甘蔗提供可靠的候选基因,本研究以电子克隆结合RT-PCR的方法,在蔗茅(Erianthus fulvus)野生种(昆明蔗茅99-1)中克隆到1个干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB)基因。生物信息学分析表明:该基因的ORF长度为720 bp,编码239个氨基酸,具有1个保守的AP2结构域,编码蛋白以α-螺旋和β-折叠为主,无跨膜结构,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,命名为ErDREB1A基因(GenBank ID:MK726363)。荧光定量PCR分析表明:在蔗茅野生种中,随着低温胁迫的延时,ErDREB1A基因的表达量逐渐增加,表明该基因表达受低温胁迫诱导。本研究为进一步研究蔗茅低温胁迫下的分子调控网络和培育耐寒转基因甘蔗提供一定科学依据。

甘蔗赤腐病病原菌的分离与ITS序列鉴定

从甘蔗赤腐病病原菌分离纯化得到5株病原真菌(CF-1、CF-2、CF-3、CF-4、CF-5),对其进行致病性测定、形态学观察和ITS序列分析。结果表明,CF-1和CF-4均能引起与田间病害一致的症状,通过ITS1和ITS4对致病菌的基因片段进行扩增,结果显示,菌株CF-1与KU933924.1相似性达到99.00%,CF-4与MH854879.1相似性达到99.42%。综合病害症状观察、形态观察和ITS序列分析结果,将甘蔗赤腐病病原菌CF-1鉴定为镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.),将CF-4鉴定为球黑孢菌[Nigrospora sphaerica (Sacc.)E.W. Mason.]。

蔗茅耐寒相关基因EfWRKY62的克隆与分析

蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)是甘蔗亚族(Subtrib.Saccharinae)、蔗茅属(Erianthus Michaux.)内的一个野生种,具有较强的耐寒特性。为挖掘和利用蔗茅耐寒基因,本研究在转录组测序的基础上利用电子克隆结合RT-PCR的技术从"蔗茅99-3"无性系中克隆到一个WRKY家族基因,该基因的开放阅读框拥有358个编码氨基酸,CDS全长1077 bp,分子量为37.4 kD,MH709119);荧光定量PCR检测结果显示,低温胁迫下,该基因在2个蔗茅(蔗茅无性系I91-8和蔗茅无性系99-3)和2个甘蔗栽培品种/系(ROC10和滇蔗04-14)的苗期均表现出上调状态。研究结果可为耐寒、适应性广的甘蔗新品种(系)的培育提供理论依据和技术支撑。

蔗茅EfNAC44基因克隆与表达分析

为了克隆蔗茅EfNAC44基因,并对其进行生物信息学和基因表达模式分析。本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从蔗茅野生种无性系‘蔗茅99-3’中克隆到一个受低温胁迫响应的NAC家族基因,命名为EfNAC44 (GenBank登录号:MH709118.1),该基因包含一个591个碱基的开放阅读框,编码196个氨基酸。利用ClustalX软件将EfNAC44编码蛋白与其他物种NAC蛋白进行同源性比较分析,发现其与高粱(XP002465328.1)同源性最高达80%。荧光定量PCR检测分析表明,该基因在蔗茅苗期能够对低温胁迫响应,低温胁迫时的相对表达量上调达到20倍。以上研究结果可为进一步挖掘利用蔗茅耐寒相关基因以及研究甘蔗抗逆性品种改良提供理论依据和技术支撑。

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC(GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。