记我师殷宏章先生二三事

前言今年 1 1月 3 0日是殷宏章先生逝世 1 0周年忌辰。中国植物生理学会暨《植物生理学通讯》编辑部约请了殷先生的一些生前友好、同事、学生 ,从各自的角度 ,就殷先生的学术成就、道德风范等各方面撰写了文章 ,特编成此专辑 ,以志纪念。殷宏章先生是我国现代植物生理学的奠基人之一。他将自己的毕生精力献给了我国的植物生理学事业 ,建立了丰功伟绩。他的高深的学术造诣和远见卓识 ,为我国植物生理学的发展奠定了基础 ,开辟了重要的研究方向。他学识渊博 ,睿智过人 ,作风严谨 ,目光敏锐 ;他道德高尚 ,淡泊名利 ,平易近人 ,和蔼可亲。所有这一切 ,永远是我们后辈和青年学子学习的楷模。愿我们努力继承和发扬殷先生的遗志 ,做出无愧于我们这个时代的科研成果 ,以告慰他老人家 !

紫云英根瘤菌Ra159的巨大质粒上存在有nod和nif基因的证明

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)Ra159中存在有两个分子量分别约为300Md(pRa159a)及大于300Md(pRa159b)的巨大质粒。以肺炎克氏杆菌的固氮酶结构基因nif HDK 片段和苜蓿根瘤菌共同结瘤基因 nod ABCD 片段作探针进行的杂交试验证明了紫云英根瘤菌的大质粒 pRa159b 上存在有 nod 基因和 nif 基因。将这些大质粒转移到 nod-nif 基因缺失的苜蓿根瘤菌突变株 Rm627-1,只有带 pRa159b 的转移接合子能在紫云英植物上形成根瘤,但这些根瘤均不能还原乙炔。

再论科学道德问题

1991年 10月 2 5日《中国科学报》(现名《科学时报》)发表的邹承鲁等 14位学部委员 (院士 )撰写的“再论科学道德问题”一文 ,阐述的科学道德问题是科技界和学术界永远值得提倡的。此文对于当前优化科研环境、树立良好道德风尚、推动精神文明建设 ,继承和发扬先进文化 ,具有积极的现实意义。我们征得《科学时报》社同意全文转载 ,推荐给广大读者。

紫云英根瘤菌基因组中存在有类似IS因子的DNA重复顺序

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)的基因组中存在有DNA重复顺序(RSRa)。它在Ra159的基因组中重复4～5次,其中一个拷贝位于nifH基因的上游。以1.25kbPvul片段作探针,在其他紫云英根瘤菌菌株及豌豆根瘤菌RI PRE中也都检测到与RSRa同源的DNA片段。序列测定的结果表明RSRa其结构类似于IS因子,具有原核插入顺序的一些特点。RSRa全长1468bp,在RSRa的两个末端具有反向重复顺序,RSRa中有一个大的开放阅读框架(ORF)。由ORF推定的蛋白与大肠杆菌插入顺序IS903推定的转座酶有较高的同源性。

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节nif/fix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因.通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii HN01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响.研究结果发现,引入Kp nifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力.同时初步试验结果证实,带额外nifA的大豆根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性.推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段.由于结瘤因子是诱导宿主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑制进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率.

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中,根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子.结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化.水稻是重要的粮食作物,能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素.将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因β-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2Bp-GUS,以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记.通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统,获得了携带嵌合基因Gmenod2Bp-GUS的水稻再生植株.以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针,检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2Bp-GUS的表达.结果表明,转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导,仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达,并且受到氮源的调控.推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.

紫云英根瘤菌nif DNA的分子克隆

固氮微生物中涉及到与固氮作用有关的基因的研究已有详细的报道. 共生固氮根瘤菌中参与固氮作用的基因有二类,一类是与肺炎克氏杆菌Kp nif基因有同源性的基因——nif基因,另一类是在共生状态进行固氮作用所必需的其它基因——fix基因.根瘤菌中nif与fix基因中的任何一个基因发生突变,根瘤菌虽仍感染宿主发育成根瘤,但不能固氮.

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）谷氨酸脱氢酶基因（ｇｄｈＡ），并研究其表达和功能，发现野生型ＩＲＣ－３ＧＤＨ＾－菌株和突变型ＩＲＣ－８ＧＤＨ＾＋菌株的ｇｄｈＡ基因都能互补大肠杆菌谷氨缺陷型菌Ｑ１００ＧＤＨ＾－的缺陷性状，但突变型ＩＲＣ－８ＧＤＨ＾＋菌侏的ｇｄｈＡ基因不能互补野生型ＩＲＣ－３ＧＤＨ＾－菌侏的谷氨酸缺陷性状，经测序发现两者苷酸序列完全一致。

紫云英根瘤菌nifH基因的结构及其上游区重复顺序的存在

在自然界有为数众多的原核生物具有固定分子氮的能力。这个过程是由固氮酶复合物即组分Ⅰ(钼铁蛋白)和组分Ⅱ(铁蛋白)催化进行的。编码组分Ⅰ的基因称nifD、nifK,编码组分Ⅱ的基因称nifH。以肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumonioe)nifHDK作为探针与不同来源的自生或共生固氮菌的DNA杂交试验表明固氮酶结构基因具较高的同源性。

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因 ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用．首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡ的重组质粒ｐＸＤ１，使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达．当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后，获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌，其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高，感染大豆幼苗后，大豆生物量的增加，如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌．

苜蓿中华根瘤菌Sm NifA蛋白与阴沟肠杆菌Ec NifA蛋白功能差异的研究

nifA基因是固氮基因nif的调节基因,其产物NifA蛋白是固氮过程的中心调节因子。将多拷贝组成型表达的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti,Sm)nifA基因或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,Ec)nifA基因引入苜蓿中华根瘤菌野生型菌株Sm 1021和苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY中,并检测这些苜蓿中华根瘤菌感染苜蓿之后根瘤的表型及固氮酶活性。实验结果表明,苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白和阴沟肠杆菌NifA蛋白在苜蓿中华根瘤菌中的功能有明显差异。在野生型菌株Sm 1021中,引入多拷贝SmnifA基因对宿主根瘤固氮效率的促进作用明显优于引入多拷贝Ec nifA基因的作用。引入多拷贝Sm nifA基因的SmY菌株(nifA突变型)能够共生固氮,而引入Ec nifA基因的SmY菌株仍然不能固氮。氨基酸序列同源性分析显示,N末端结构域是Sm NifA蛋白和Ec NifA蛋白同源性最低的功能域。进一步研究表明,Sm NifA蛋白的N末端结构域在互补苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY的固氮功能时是必需的。

具有广泛寄主范围转移特性的Tn5-nifA重组质粒的构建

固氮作用调节的研究指出固氮基因(nif基因)受氨和氧的阻遏.近几年来,已有报道基因nifA产物引起氨存在下固氮酶合成的去阻遏作用.1983年,Zhu等构建了一个带有nifA的重组质粒pST1021引入野生型和gln突变型的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae),两者在氨存在下都发生固氮酶合成的去阻遏作用.

苜蓿根瘤菌nodD3P1启动子下游序列的调节功能

苜蓿根瘤菌 (Rhizobiummeliloti)结瘤正调节基因nodD3的P1启动子到编码区间有一长6 6 0bp的序列 ,称为P1下游序列 ,内含两个潜在的开放阅读框 (ORF) ,即ORF1和ORF2 .其中ORF2可编码一个含 86个氨基酸残基的多肽 .构建P1下游序列缺失的一系列nodD3P1启动子lacZ转录融合子 ,测定它们的表达活性 ;并进一步研究ORF2对nodD3P1启动子表达的影响 。

苜蓿根瘤菌多拷贝固氮基因启动子对根瘤发育的抑制

以荧光素酶基因作为报道基因研究苜蓿根瘤菌nif/fix基因在根瘤发育过程中的激活,发现多拷贝的nifHDK启动子和fixABCX启动子抑制根瘤的发育和固氮活性,与nifA突变型的表型相同.用β-半乳糖苷酶基因作为报道基因得到同样的结果。但是低拷贝的nifHDK启动子或fixABCX启动子对根瘤发育和固氮活性没有影响。固氮基因启动子的多拷贝抑制效应进一步说明nifA产物除了作为共生固氮基因转录的正调节因子外,对根瘤的发育也有作用。

苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nifA基因的异源表达及其产物的氧敏感性

当在土壤农杆菌、三叶草根瘤菌和紫云英根瘤菌中分别引入Rm nifA'-lacZ的质粒,可以测得β-gal活力,但其活力不受微氧诱导。当带有Rm nifA'-lacZ的三叶草根瘤菌和紫云英根瘤菌处于共生状态,β-gal的活力也无明显提高。推测苜蓿根瘤菌 nifA的诱导激活是受某些因子如fixLJ的专一作用。以大肠杆菌为材料在有氧和微氧下观察nifH'-lacZ受nifA的激活表达。RmnifA在有氧下不能激活Rm nifH'-lacZ和KpnifH'-lacZ的表达。同时证实RmnifA的mRNA在有氧下含量显著减少。

NifA蛋白的N末端结构域决定肺炎克氏杆菌和阴沟肠杆菌中NifA蛋白的温度敏感性

NifA蛋白是固氮基因的中心调节物 .它激活nif基因转录时依赖于σ5 4 RNA聚合酶全酶 .肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae ,Kp)NifA蛋白由 3个结构域组成 ,即功能不明的N末端结构域 ,具有ATP酶活性的中心催化结构域和C末端DNA结合结构域 .KpNifA蛋白对温度敏感 ,而阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae ,Ec)NifA蛋白的温度敏感性不如KpNifA蛋白 .

苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)nodD3P1启动子下游序列的缺失和互补分析

在苜蓿根瘤菌中,nodD3基因的转录由两个彼此分离的启动子P1和P2控制.在P1下游是一段由660 bp组成的序列,接着是nodD3的编码区.由P1下游序列3’末端开始缺失得到的一系列缺失突变体的遗传分析指出,P1下游+1～+125 nt序列对P1的表达是必须的.互补分析和结瘤试验指出,ORF2自我抑制P1的表达,而+1～+125nt序列可对抗ORF2对P1的抑制作用.

紫云英根瘤菌基因文库的构建和结瘤基因片段的分离

根瘤菌(Rhizobium)与寄主豆科植物的共生涉及到根瘤菌和植物之间的识别;根瘤菌的浸染;根瘤的形成;根瘤菌类菌体的发育等一系列复杂的过程。 在苜蓿根瘤菌(R. meliloti)中决定引起根瘤的结瘤基因(nod gene),目前已经鉴定出nodA,B,C,D。因为这类基因在多种根瘤菌中都被找到,而且在功能上可以互补。

苜蓿根瘤菌固氮酶基因启动子P1转录起始点下游顺序(DS)的特性

自生状态的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nifHDK操纵子的启动子P1能被微氧诱导而呈高水平表达,而fixABCX操纵子的启动子P2则呈微弱的表达.P1和 P2的 DNA顺序从转录起始点到上游-160处具有 85％的同源性,但从转录起始点到翻译起始点的核苷酸顺序则完全不同.用P1转录起始点下游从+17到+61核苷酸的DNA片段(DS)取代P2区的相应的DNA顺序,在自生状态微氧诱导条件下能提高P2的表达水平,在大肠杆菌中有NifA存在时P2亦呈高水平表达,说明P1和P2区的DS顺序是决定P1和P2自生状态微氧诱导条件下表达或异源表达差异的根本原因.在共生状态下P2的表达不依赖启动子下游顺序.采用引物延伸法测定 P2的转录起始点,发现 P2区当引入 P1区的 DS后不改变它的转录起始点.由于P2不论有DS的插入与否均不影响其在根瘤菌共生状态的正常表达,因此P2在自生状态的根瘤菌中与共生状态时的表达调节将有所不同.