Dmd基因突变小鼠构建及在肌肉及免疫系统的表型验证

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建抗肌萎缩蛋白(dystrophin,Dmd)基因第23号外显子点突变的Dmd基因突变小鼠,分析并验证该小鼠在肌肉及免疫系统中的表型变化,为杜氏肌营养不良症等疾病提供评价模型。方法针对Dmd基因23号外显子序列特征,设计合成小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),将Cas9 mRNA、sgRNA片段和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,并将该受精卵移植至代孕鼠后出生获得F0代小鼠,F0代小鼠通过交配获得子代小鼠后,基因型鉴定筛选得到Dmd基因阳性突变小鼠(命名为Dmd^(Mu/+)小鼠)。选择3月龄和9月龄的雄性半合子Dmd^(Mu/+)小鼠(命名为Dmd^(Mu/Y)小鼠)和野生型C57BL/6J小鼠(作为对照)用于表型验证:称量记录活体小鼠体重,并通过悬挂实验检测小鼠肌张力,采集心脏和半腱肌,采用HE染色法观察组织病理学变化,进一步通过蛋白质印迹法检测9月龄小鼠肌肉组织内Dmd蛋白的表达情况。利用脂多糖诱导建立Dmd^(Mu/Y)小鼠急性炎症模型,采集小鼠颌下静脉血,采用流式细胞术检测外周血中性粒细胞和单核细胞比例变化。结果基因组测序和蛋白质印迹结果表明Dmd基因点突变小鼠(即Dmd^(Mu/+)小鼠)构建成功,Dmd^(Mu/+)小鼠骨骼肌和心肌中未见Dmd蛋白表达,与野生型C57BL/6J小鼠相比明显下降(P<0.05)。与背景相同的野生型小鼠相比较,3月龄和9月龄的雄性半合子突变小鼠(Dmd^(Mu/Y)小鼠)体重明显减轻(P<0.01),肌张力显著下降(P<0.05),9月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的骨骼肌和心肌发生肌间隙变宽等明显病变。未注射脂多糖时,与野生型小鼠相比,3月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞和单核细胞比例显著降低(P<0.01),经脂多糖诱导后,3月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞比例仍然较野生型小鼠显著降低(P<0.01),而9月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠的外周血中性粒细胞比例在脂多糖诱导后显著升高(P<0.05),但较野生型小鼠仍显著降低(P<0.01),同月龄Dmd^(Mu/Y)小鼠经脂多糖诱导后外周血单核细胞比例与野生型小鼠相比仅有偏低趋势(P>0.05)。结论成功构建了Dmd基因突变小鼠模型,证实该基因具有维系肌肉组织正常形态和肌张力等重要功能,并初步发现该基因缺失会减少外周血液中性粒细胞比例,为后续研究杜氏肌营养不良症患者的免疫系统异变机制提供新的思路。

Onconase对B16黑色素瘤细胞的体内外生长抑制作用

Onconase(Onc)是一种从林蛙(Rana pipiens)卵细胞内提取的核酸酶,实验证实其在体外和体内对多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤效果。在大肠杆菌中表达纯化的重组Onc和天然提取蛋白质具有相似的活性,通过测定该蛋白质对黑色素瘤B16细胞的IC50和建立荷瘤小鼠模型探讨了Onc体内外的抗肿瘤效果。实验结果表明:B16细胞在体外对Onc敏感性较K562细胞低,其IC50为6.37μmol/L;但体内每次每只小鼠给予5mg/kg Onc也可显著地抑制B16细胞的生长,延长小鼠的生存时间。实验提供了一种简化高效获得具有天然活性Onc的方法,同时通过Onc对低敏感性肿瘤黑色素瘤细胞的杀伤研究,丰富了对Onc抗肿瘤作用的认识,为治疗黑色素瘤提供了线索。

Rag1、Rag2基因缺陷小鼠的构建及在异种肿瘤移植中的应用

目的 建立重组激活基因,Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,并对其表型和异种肿瘤移植的成瘤性进行分析.方法 通过传统的胚胎干细胞（ES）细胞打靶、囊胚注射方式,分别构建Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型;通过流式细胞术对缺陷小鼠外周血T/B淋巴细胞含量进行检测;通过外源异种肿瘤细胞移植实验,对移植肿瘤细胞的成瘤性进行评价.结果 建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种基因突变纯合子小鼠模型外周血中T、B淋巴细胞含量较野生型小鼠显著降低;人源肿瘤细胞A549在上述两种基因突变纯合子小鼠中较BALB/c-nu（裸小鼠）或（NOD-SCID）非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠表现出更强的成瘤性.结论 分别成功建立了Rag1和Rag2基因缺陷小鼠模型,两种小鼠模型均发生了T、B淋巴细胞生成障碍,导致免疫系统严重缺陷,可作为异种外源肿瘤移植的受体,用于小鼠荷瘤模型的建立.

淋巴细胞活化基因-3敲除(Lag-3-/-)小鼠构建及初步表型分析

目的构建淋巴细胞活化基因-3(Lag-3)基因敲除小鼠,初步分析Lag-3基因敲除对小鼠表型影响,为后续Lag-3体内功能研究提供动物模型。方法利用CRISPR/Cas9技术结合受精卵显微注射构建敲除小鼠,通过分子鉴定筛选基因敲除阳性小鼠,利用RT-PCR和流式检测方法进一步验证Lag-3基因敲除小鼠体内Lag-3基因敲除效果;通过建立Con A诱导的肝损伤模型研究Lag-3基因在体内的功能。结果PCR和产物测序结果显示,获得了exon 2缺失的Lag-3基因敲除小鼠;该基因敲除纯合子小鼠(Lag-3-/-)经刀豆蛋白(Con A)刺激后,小鼠心脏、脾、肺、巨噬细胞和淋巴结中仅能检测到Lag-3 mRNA本底表达信号,小鼠巨噬细胞、脾细胞和淋巴结中仅能检测到非常低数量的Lag-3阳性细胞。表型分析发现,Lag-3基因的缺失显著减少了Con A诱导的小鼠外周血、骨髓和脾CD3+T细胞的数量,减轻了Con A诱发的急性肝损伤情况。结论成功构建Lag-3基因敲除小鼠模型,肝损伤过程中的体内功能研究显示,Lag-3缺失可以显著缓解Con A引发的肝损伤的发生。

基于ΦC31整合酶和载体质粒pUASTattB的12株果蝇转基因阴性对照品系的建立

目的构建基于ΦC31整合酶和载体质粒pUASTattB的果蝇转基因系统的阴性对照品系,为转基因果蝇研究实验提供更科学的阴性对照。方法用显微注射法将载体质粒pUASTattB(可携带目的基因完成定点插入的常用载体质粒)转入携带ΦC31整合酶的4种不同遗传背景的果蝇品系attP-25C6、attP-68A4、attP-75B1和attP-86F8胚胎中,培养获得G0代成虫后将每只G0代成虫分别与平衡子果蝇品系ywR13S做单管杂交(每管中G0代成虫1只与ywR13S3只进行杂交),通过观察G1代果蝇的复眼颜色,判断是否有mini-White插入,计算成功插入的概率。再选取成功插入mini-White的G1代果蝇成虫与3种平衡子果蝇品系DB、ywR13S和yw122分别做单管杂交(1只G1代雄果蝇与3只平衡子品系处女蝇杂交),平衡保种。提取保种好的果蝇品系基因组DNA,用PCR法鉴定载体质粒pUASTattB转入情况。结果4种不同遗传背景的果蝇成功显微转入pUASTattB质粒后,再用3种平衡子果蝇品系进行平衡保种,得到12株果蝇品系,均为携带mini-White标记的红眼果蝇,PCR鉴定表明有pUASTattB序列插入。结论12株转基因果蝇品系可基本满足以pUASTattB为载体构建的转基因果蝇研究实验的阴性对照需求,丰富了国家果蝇资源中心的果蝇资源。

模式动物疾病模型在结直肠癌医学研究中的应用进展

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤,最新统计数据显示CRC发病人数占全球癌症病例总数的10%,为癌症死亡的第二大主因。CRC是一种高度异质性疾病,其发生发展是由多个基因表达突变引起功能异常或表观遗传变化所驱动,并经过不同途径发展为肿瘤。由于遗传、环境、伦理以及患者本身个体差异等复杂因素限制了CRC在人体上的研究,动物疾病模型已成为研究该疾病必不可少的工具,在预防、治疗、临床前研究和基础性研究中发挥重要作用。CRC疾病模型种类丰富,其中小鼠模型应用最为广泛,根据造模方式不同分为自发性、化学诱导、移植瘤和基因工程小鼠模型,各有其不同特点及应用前景。本文重点阐述CRC小鼠模型,同时介绍大鼠、实验猪、斑马鱼等动物模型的最新研究进展,以期为CRC动物模型的选择和应用提供参考。

乳胶血管灌注技术制作小鼠头面部静脉血管模型方法初探

目的优化乳胶灌注技术,并将该技术应用于小鼠头面部静脉血管模型制作。方法将9只8周龄、体质量(25.0±1.3)g的雄性C57BL/6小鼠随机分成60%乳胶生理盐水组、60%乳胶肝素组和30%乳胶肝素组,相应试剂灌注完成后将标本浸泡于4℃甲醛固定液中,24h后解剖观察并测量颈外血管直径。结果于小鼠颈外静脉灌注乳胶灌注液200μL后,各组小鼠的眶上静脉、眶下静脉、颞静脉、面后静脉、咬肌静脉、颈外静脉等均得到灌注,通过对灌注后面部血管末端分支、舌下静脉及舌尖小静脉的灌注程度比较后发现,30%乳胶肝素组的灌注效果最佳,其次为60%乳胶肝素组,而60%乳胶生理盐水组的灌注效果最差。结论优化后的乳胶灌注技术可有效灌注小鼠头面部的静脉血管,该技术可为小鼠面部静脉血管的走向及形态研究提供很好的参考。

雄性不育药物研发相关实验动物模型建立和应用进展

近年来男性不育发病率不断上升,急需开展雄性不育发病机制和相应药物研发,以应对我国人口出生率下降和老龄化等新问题。雄性不育动物模型的构建和应用是其中很重要的一环,它对于准确评价不育治疗药物的药效及作用机制等都具有重要作用。合适的不育动物模型不仅可以减少药物药效的重复评价,降低动物使用和新药研发成本,而且对于后续临床试验也具有重要的参考价值。雄性不育动物模型可以通过化学、物理、内分泌、环境雌激素、基因修饰和免疫等方法构建。本文主要介绍了现有的雄性不育药物研发相关实验动物模型,并对各模型应用现状进行了简要介绍,以期为雄性不育药物研发人员提供有益的参考。

C57BL/6J、129/SvJ及其杂交一代小鼠的行为学比较研究

目的比较C57BL/6J和129/SvJ两种不同遗传背景及其杂交一代(F1)在行为学表型上的差异。方法将C57BL/6J小鼠和129/SvJ小鼠交配繁育,得到两种F1小鼠129B6F1和B6129F1,连同C57BL/6J和129/SvJ按照不同性别分为8组,每组小鼠数量n≥12,进行旷场活动、悬尾、水迷宫、被动回避、热板实验等行为学研究,分别从焦虑、抑郁、学习记忆、热痛四个方面比较C57BL/6J和129/SvJ小鼠及F1小鼠的行为表现。结果在旷场活动中,与129/SvJ比较,F1在外周、边缘的活动差异显著(P<0.01);在悬尾活动中,F1的行为没有显著性差异;在水迷宫和被动回避活动中,与C57BL/6J比较,F1寻找到平台的潜伏期和进入暗箱的潜伏期差异显著(P<0.05)。结论 F1的不同行为表型受到亲代的不同遗传背景影响。

不同剂量舒泰联合盐酸赛拉嗪对C57BL/6J小鼠的麻醉效果观察

目的使用不同剂量的舒泰联合盐酸赛拉嗪麻醉C57BL/6J小鼠,观察小鼠在不同麻醉剂量下的麻醉相关时间,为各类小鼠手术及相关实验设计提供参考。方法 100只C57BL/6J小鼠(雌雄各半)随机分成5组,每组20只(雌雄各半)。4个给药组小鼠分别按照舒泰55 mg/kg+盐酸赛拉嗪13.75 mg/kg、舒泰65 mg/kg+盐酸赛拉嗪16.25 mg/kg、舒泰75 mg/kg+盐酸赛拉嗪18.75 mg/kg、舒泰85 mg/kg+盐酸赛拉嗪21.25 mg/kg的剂量进行腹腔注射;小鼠翻正反射消失后,于双眼各滴注新乐敦滴眼液1滴(约20μL),放置小鼠于保温垫上。对照组小鼠腹腔注射200μL的0.9%氯化钠溶液。观察、记录并比较各组小鼠的麻醉诱导时间、麻醉维持时间、麻醉恢复时间。小鼠麻醉苏醒后饲养1 d,取血清,采用日立7080全自动生化分析仪测定肝肾功能指标:谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐。结果舒泰联合盐酸赛拉嗪麻醉C57BL/6J小鼠的成功率为100%。当舒泰麻醉剂量在55~75 mg/kg时能迅速且安全地诱导小鼠麻醉,麻醉效果良好。麻醉维持时间与舒泰注射剂量成正比(雄鼠r;=0.827,雌鼠r;=0.841,P值均<0.05),麻醉诱导时间与注射剂量成反比(雄鼠r;=0.432,雌鼠r;=0.410,P值均<0.05)。麻醉苏醒后,各组小鼠的肝肾功能指标与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论使用55~75 mg/kg舒泰联合盐酸赛拉嗪麻醉C57BL/6J小鼠可得到较好的麻醉效果且安全,并且可通过调整麻醉药剂量控制麻醉时间,提示这是一种稳定可靠的麻醉方法。

人工合成囊素三肽的急性毒理研究——对农村生产影响

囊素三肽是从鸡法氏囊抽提液中提取的一种称为Bursin的三肽物质,氨基酸顺序为Lys-His-GlyNH2。本实验利用尾静脉注射给药的方式研究了单剂量条件下人工合成的囊素三肽对实验小鼠的急性毒性作用。研究表明,以10mg/kg高剂量通过尾静脉注射给药方式一次性注射到ICR小鼠体内未见毒性反应发生;小鼠体重、行为活动、状态、大便、小便、毛色、分泌物及死亡等情况也未见异常;血生化指标和脏器病理检测也未发现病理异常和特异性病变,证明人工合成的囊素三肽对实验小鼠无明显急性毒性作用,应用较安全。

基于CRSIPR/Cas9技术构建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型验证

基于CRISPR/Cas9技术构建凝血因子8(F8)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。针对F8基因外显子1非编码区和外显子26下游序列设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F_(0)代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得F8基因敲除纯合子小鼠(F8^(-/-)小鼠);通过逆转录PCR(RT-PCR)检测主要组织中F8基因在mRNA水平的表达情况,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中F8基因在蛋白水平的表达情况;通过活化部分凝血活酶时间检测(APTT)和纤维蛋白原含量(FIB)测定实验检测F8基因敲除后小鼠凝血功能情况。PCR及测序结果表明F8基因在小鼠基因组中被成功敲除;RT-PCR和ELISA检测结果显示,F8^(-/-)小鼠中F8在mRNA和蛋白水平上表达均显著低于野生型小鼠(WT小鼠)(P<0.0001,P<0.01);APTT、FIB和滴血实验检测结果显示,F8^(-/-)小鼠血浆凝固时间显著高于WT小鼠(P<0.05),F8^(-/-)小鼠存在严重凝血障碍表型,给予人凝血因子Ⅷ后凝血可恢复到正常水平。利用CRISPR/Cas9技术成功构建F8基因敲除小鼠模型并初步验证其表型,证实该小鼠F8基因的缺失可以导致凝血功能障碍。

Toll样受体4(TLR4)基因剔除小鼠构建及初步表型分析

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Toll样受体4(TLR4)基因敲除小鼠模型,并观察突变小鼠对革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)刺激响应的变化。方法:针对TLR4基因外显子2设计并合成1对sgRNA片段,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法,建立TLR4基因敲除小鼠,通过繁育获得基因敲除纯合子小鼠(TLR4-/-小鼠);通过LPS刺激,分析TLR4-/-小鼠对炎症应激的反应情况,并在分子和病理水平上和野生型对照(WT)进行比较。结果:PCR及测序检测表明TLR4基因外显子2在小鼠基因中被成功敲除;给予LPS刺激后,IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa等炎症因子的表达在野生型小鼠的心、肝和肺组织中显著上调,而在TLR4-/-小鼠中则几乎没有变化;血生化指标显示LPS刺激后WT小鼠血清中的尿素(Urea)和肌酐(Cre)水平显著升高,而TLR4-/-小鼠刺激前后无显著变化,病理分析同样发现TLR4-/-小鼠能够抵抗LPS对肾组织的损伤。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TLR4基因剔除小鼠模型,TLR4的缺失能够降低IL1β、IL6、My D88、i NOS及TNFa炎症因子对LPS刺激的响应,抑制LPS引起的炎症反应及对组织的损伤。

Tmem119基因敲入荧光示踪工具小鼠的构建及表型验证

[目的]通过将tdTomato基因片段插入到Tmem119基因终止密码子位置建立了Tmem119-tdTomato工具小鼠模型,并对该小鼠进行表型验证。[方法]制备Tmem119 sgRNA、Cas9 mRNA和donor vector,利用CRISPR/Cas9技术通过显微注射共同注射到C57BL/6小鼠受精卵中,通过交配及基因型鉴定获得F1代阳性小鼠;通过荧光检测验证小鼠Tmem119蛋白在大脑各区域的表达情况。[结果]基因型检测结果表明,tdTomato表达片段成功插入到Tmem119基因终止密码子前;免疫荧光检测结果表明,tdTomato蛋白荧光在小胶质细胞内与经典标记蛋白Iba1荧光重叠,与星形胶质细胞标记蛋白GFAP不重叠。[结论]成功构建特异性标记小胶质细胞的红色荧光示踪工具小鼠,为小胶质细胞的动态深入研究提供模式工具。

羚珠散对幼鼠反复热惊厥的防治作用及机制研究

目的:通过评价羚珠散对C57BL/6幼鼠反复热惊厥的减轻作用,探讨其防治热惊厥的药效和可能作用机制。方法:将7 d龄C57BL/6幼鼠30只分为空白对照组、模型对照组和治疗组,每组各10只。采用热水浴法干预模型对照组与治疗组,生成惊厥模型,每次诱导前30 min治疗组灌胃给药羚珠散(1.5 g/kg),模型对照组灌胃同等体积0.9%氯化钠注射液。观察治疗组与模型对照组幼鼠的惊厥潜伏期和惊厥持续时间的差异,通过HE染色比较各组间幼鼠海马体病理组织学差异,通过Real-time PCR与IHC分析比较空白对照组、模型对照组及治疗组幼鼠海马体中Gabbr1和Kcnt1基因的表达差异。结果:经7次热水浴后,模型对照组幼鼠的惊厥潜伏时间为(32.80±3.27)s,治疗组幼鼠的惊厥潜伏时间为(50.90±6.88)s,治疗组的惊厥潜伏时间长于模型对照组(P<0.05);模型对照组幼鼠的惊厥持续时间为(104.40±14.37)s,治疗组幼鼠的惊厥持续时间为(45.40±7.10)s,治疗组的惊厥持续时间显著短于模型对照组(P<0.01);HE染色显示热惊厥状态对模型对照组幼鼠海马神经元损伤明显,细胞肿胀、核皱缩,出现空泡现象,治疗组幼鼠海马神经元损伤减轻,细胞水肿及空泡等现象减轻;治疗组幼鼠中Gabbr1和Kcnt1的mRNA表达水平高于模型对照组幼鼠(P<0.05);免疫组化检测幼鼠海马区中Gabbr1和Kcnt1的阳性细胞比例治疗组高于模型对照组(P<0.01,P<0.05)。结论:羚珠散具有显著防治幼鼠热惊厥发作的作用,其机制可能与显著提高Gabbr1与Kcnt1表达,增强GABA抑制神经兴奋作用,减轻海马区神经元损伤有关。

羚珠散对小鼠癫痫发作的预防作用及机制探讨

目的:评价羚珠散治疗小鼠癫痫发作的预防作用及机制。方法:将25只C57BL/6小鼠随机分成3组,其中模型组和给药组每组各10只,正常组5只。采用腹腔注射戊四氮的方法制备癫痫模型,给药组每次造模前30 min灌胃羚珠散(剂量:1500 mg/kg)进行预防给药,每2 d重复一次造模和给药,共进行3次;正常组给予同体积0.9%氯化钠注射液。通过Racine评分评价造模后小鼠癫痫发作情况,于末次注射24h后分离各组小鼠大脑皮层和海马组织,通过Real-time PCR和免疫组化检测小鼠Gabbr1和Kcnt1基因蛋白表达情况。结果:Racine评分模型组显著高于正常组(P<0.0001),给药组显著低于模型组(P<0.0001);HE染色切片显示,药物作用后可以有效减少海马体组织细胞的损伤,与正常组接近;给药组海马组织中Gabbr1基因表达显著高于模型组(P=0.0335),但与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05);Kcnt1基因表达显著高于模型组(P=0.0139)与正常组(P=0.0063)。免疫组化结果显示,给药组中,小鼠海马组织Gabbr1和Kcnt1蛋白表达程度高于模型组(PGabbr1=0.0194,PKcnt1=0.0037)与正常组(PGabbr1=0.0094,PKcnt1=0.0255)。结论:羚珠散具有预防和抗小鼠癫痫的作用,其机制可能与钾离子通道KCNT1介导的抑制作用有关。

豹蛙核酸酶与斑蝥酸钠对肺腺癌细胞增殖的协同抑制作用

豹蛙核酸酶(onconase,Onc)是从美洲北方豹蛙卵母细胞中提取的一种核糖核酸酶,对许多肿瘤细胞都具有杀伤作用。斑蝥素(cantharidin)是存在于芫青科昆虫斑蝥体内的一种天然防御性毒素,斑蝥酸钠(sodium cantharidate,SCA)是斑蝥素半合成衍生物。鉴于Onc与SCA对非小细胞肺癌都具有杀伤作用,采用MTT法测定Onc与SCA单独与联合作用于两株肺腺癌细胞的IC50值,运用联合作用指数(combination index,CI)和等效线分析评价两者联合作用的效果。结果表明,Onc与SCA联合作用时,CI值均小于0.7,等效线分析图显示,代表Onc与SCA联合作用的点均位于加成线下方,Onc与SCA对肺腺癌SPC-A-1、A549细胞株增殖的抑制作用具有协同效应。用流式细胞仪进行的凋亡细胞检测结果也支持上述"Onc/SCA联合使用具有协同抗癌作用"的结论。

Onconase研究与开发的最新进展

Onconase是一种在北方豹蛙(Rana pipiens)卵母细胞和早期胚胎内存在的核糖核酸酶,是RNase A超家族中的一员,研究证实它在体内外对多种肿瘤均具显著杀伤作用。Onconase目前已经作为抗肿瘤药物上市,用于治疗恶性间皮瘤。Onconase结构独特,高度稳定。在临床上,Onconase具有副反应较轻,免疫原性低和不易产生耐药性等优点。因此Onconase的研究在学术上和医学应用上均具重要意义。本文综述了Onconase的结构特点、催化专一性、细胞毒性、体内外抗肿瘤活性及其临床应用的最新进展,并讨论了与其相关的一些重要问题。

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的:程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法:构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F0代阳性小鼠。F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代杂合子小鼠,再通过F1代小鼠自交获得F2代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果:Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。

Pd-1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的:细胞程序性死亡蛋白(programmed death ligand-1,PD-1)是机体T细胞的免疫检查点,也是肿瘤治疗的重要靶点。采用CRISPR/Cas9技术,利用非同源重组修复引入突变的方式,使基因蛋白读码框移码造成PD-1功能缺失,建立Pd-1基因敲除小鼠模型,为深入探究Pd-1基因功能及作用机制提供基础。方法:针对Pd-1基因2-4号外显子设计并合成2对sgRNA片段,与编码Cas9片段共同体外转录,通过受精卵显微注射方法将两者mRNA混合注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经PCR产物测序鉴定获得F0代小鼠,之后与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代杂合子小鼠,F1代小鼠自交即获得F2代纯合子小鼠品系(Pd-1^(-/-))。刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)刺激Pd-1^(-/-)小鼠后,通过实时荧光定量PCR和流式细胞技术在mRNA和蛋白水平上分别检测Pd-1^(-/-)小鼠中Pd-1基因在转录和翻译过程中的表达情况,并通过ELISA方法检测Pd-1^(-/-)小鼠血清中IL-6、IFN-γ、IL12/IL23及TNF-α等因子的表达水平,初步分析Pd-1通路在T细胞反应调控中的作用机制及对免疫刺激的响应情况。结果:PCR及测序结果表明在小鼠基因组中Pd-1基因2-4号外显子被成功敲除;Real-Time PCR实验和流式检测结果显示:与野生型小鼠相比,Pd-1^(-/-)小鼠脾、肠系膜淋巴结、胸腺和血液各组织中Pd-1表达水平均显著降低;双抗夹心ELISA测定结果显示:Pd-1敲除后经ConA刺激,血清中IL-6和IFN-γ表达上调。结论:成功构建Pd-1基因敲除小鼠模型。Pd-1缺失能够上调IL-6和IFN-γ对ConA刺激的响应,增加ConA引起的炎症反应,为Pd-1的体内基因功能研究提供了新的小鼠模型和研究思路。