丹参酮ⅡA通过自噬诱导肺癌A549细胞周期阻滞的作用研究

目的观察丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TⅡA)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响,探讨TⅡA诱导A549细胞自噬与细胞周期阻滞的关系。方法采用CCK8法检测TⅡA(0.5、1、2、4、8μmol·L^-1)对A549细胞增殖的抑制作用;利用流式细胞术检测TⅡA(1、2、4μmol·L^-1)对A549细胞周期分布的影响;采用Western Blot法检测TⅡA(1、2、4μmol·L^-1)对A549细胞周期相关蛋白Cyclin D1和自噬相关蛋白p62、LC3B表达的影响;分别采用自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA;0.25μmol·L^-1)+TⅡA(2μmol·L^-1)或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol·L^-1)+TⅡA(2μmol·L^-1)培养处理A549细胞,然后采用Western Blot法检测细胞Cyclin D1、p62、LC3B蛋白的表达,并通过流式细胞术检测细胞周期分布。结果与对照组比较,TⅡA不同浓度组对A549细胞均具有明显的增殖抑制作用(P<0.05,P<0.01),且呈时间-剂量依赖关系;药物作用12、24 h后,TⅡA的IC50值分别为7.82、2.04μmol·L^-1。与对照组比较,TⅡA能降低A549细胞Cyclin D1的表达量(P<0.01),使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖性;TⅡA能够升高A549细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P<0.05,P<0.01),降低p62表达(P<0.01),诱导细胞发生自噬。与TⅡA组比较,3-MA+TⅡA组A549细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显降低(P<0.01),p62及Cyclin D1表达水平明显上调(P<0.01),停滞于G0/G1期的细胞比例明显减少(P<0.05)。结论TⅡA可能通过上调人非小细胞肺癌A549细胞自噬诱导细胞周期阻滞,从而抑制细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。

KBN触变凝胶剂对非感染性炎症模型动物的抗炎作用及机制研究

【目的】观察KBN触变凝胶剂(由黄连、龙胆等10味中药组成)的抗炎药效,并从核转录因子-κB(NF-κB)信号通路初步探讨其作用机制。【方法】将60只SD大鼠随机分为空白组,模型组,地塞米松组,KBN低、中、高剂量(生药质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 g·mL-1)组,每组10只。采用右后足垫皮下注射角叉菜胶法建立大鼠足跖肿胀模型。测量各组大鼠不同时间点的足容积,计算足肿胀度,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测大鼠足部软组织中NF-κB p65、核转录因子抑制蛋白(IκBα)、环氧合酶2(COX-2)的表达。另将60只KM小鼠随机分为空白组,模型组,地塞米松组,KBN低、中、高剂量组(生药质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 g·mL-1),每组10只。采用涂布二甲苯法诱导小鼠耳廓肿胀模型。小鼠打耳片称质量,计算耳肿胀度,采用免疫组化(IHC)法检测小鼠耳廓组织中NF-κB p65、IκBα的表达水平。【结果】与模型组比较,KBN低、中、高剂量组大鼠足肿胀度在致炎后0.5~6 h降低,血清TNF-α、IL-1β含量显著降低,足部软组织NF-κB p65、COX-2表达降低、IκBα表达增加,均呈剂量依赖性。与模型组比较,KBN低、中、高剂量组小鼠耳肿胀度显著降低,耳廓组织中NF-κB p65表达降低,IκBα表达增加,均呈剂量依赖性。【结论】KBN触变凝胶剂具有良好的抗炎作用,其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化进而降低炎症因子的释放有关。

早期母婴分离联合成年慢性不可预知性应激抑郁大鼠模型的建立与评价

目的:探讨早期母婴分离应激联合成年慢性不可预知性应激制备成年SD大鼠抑郁模型,观察大鼠行为学表现和突触蛋白的表达。方法:将刚出生的24只雄性大鼠随机分为空白组(CON组)、慢性不可预知性应激组(CUMS组)、母婴分离联合慢性不可预知性应激组(MS+CUMS组),每组8只。CUMS组大鼠成年期采用慢性不可预知性应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)建立抑郁模型,MS+CUMS组大鼠采用母婴分离+慢性不可预知性应激建立大鼠成年期抑郁模型。采用体质量和外观观察、糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验评价大鼠抑郁模型;免疫组化检测海马中Syn的表达以及Western blot检测大鼠海马PSD-95、Syn蛋白表达水平。结果:(1)应激造模结束后,与CON组相比,CUMS组和MS+CUMS组大鼠体质量明显降低[(126.43±3.88) g,(91.04±3.85) g,(69.89±6.67) g;t=5.03,8.03,均 P<0.01],糖水偏好度显著下降[(94.21±0.56)%,(79.30±1.13)%,(72.73±1.82)%;t=8.24,11.87,均 P<0.01),不动时间明显增加[(3.50±0.84) s,(13.59±2.40) s,(15.70±2.97) s;t=3.16,3.82,均 P<0.01];其中,MS+CUMS组的体质量和糖水偏好度比CUMS组大鼠的更低( t=3.00,3.63,均 P<0.01)。(2)与正常组相比,MS+CUMS大鼠的中央区域活动时间明显缩短[(21.41±4.65) s,(8.96±2.37) s;t=2.66, P<0.05]。(3)在免疫组化实验中,与正常组相比,CUMS组和MS+CUMS组大鼠海马Syn阳性面积百分比明显减少[(24.42±0.76)%,(14.00±0.95)%,(10.38±1.38)%;t=6.93,9.33, P<0.01)]。(4)Western blot结果显示,与CON组相比,CUMS组和MS+CUMS组大鼠海马中PSD-95[(1.18±0.02),(0.74±0.06),(0.52±0.05);t=6.29,9.31,均 P<0.05]和Syn[(1.12±0.08),(0.95±0.06),(0.90±0.07);t=3.10,4.04,均 P<0.05]蛋白的表达情况明显下降;其中,与CUMS组相比,MS+CUMS组的PSD-95的蛋白表达更低[(0.74±0.06),(0.52±0.05);t=0.93, P<0.05]。 结论:母婴分离联合CUMS应激造模能诱发大鼠出现抑郁样行为,降低海马突触可塑性相关蛋白的表达。

基于细胞焦亡探讨琴叶榕提取物对急性酒精性肝损伤的保护机制

目的:研究细胞焦亡在琴叶榕根的不同溶剂提取物保护急性酒精性肝损伤中的作用。方法:56只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组,模型组,水飞蓟宾组(60 mg·kg^-1),鲜药水提物组(48 g·kg^-1),干药水提物组(48 g·kg^-1),干药50%醇提物组(48 g·kg^-1),干药95%醇提物组(48 g·kg^-1),每组8只。其中水飞蓟宾和不同溶剂的琴叶榕提取物,各组小鼠灌胃给药18 d,正常组与模型组小鼠灌胃给予等体积的纯水。灌胃给药15 d后,模型组、水飞蓟宾组和各个琴叶榕根提取物组小鼠给予50%乙醇(12 mL·kg^-1)灌胃,建立急性酒精性肝损伤模型。末次造模结束后禁食14 h后摘眼球取血,开腹取肝脏,计算肝脏指数,苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理学变化;试剂盒检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;硫代巴比妥酸(TBA)法检测肝脏丙二醛(MDA)含量,微板法检测乳酸脱氢酶(LDH)水平;肝脏组织切片末端标记法(TUNEL)染色检测肝细胞焦亡;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞焦亡相关蛋白。结果:与正常组比较,模型组ALT,AST,MDA,LDH水平显著升高,肝脏指数显著升高,TUNEL染色阳性、炎症因子、焦亡相关蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,各个琴叶榕根提取物给药干预组小鼠ALT,AST,MDA,LDH水平均明显下降(P<0.05),肝脏指数有不同程度的下降,TUNEL染色阳性、炎症因子、焦亡相关蛋白表达水提物处理组明显下降(P<0.05);肝脏病理切片表明,琴叶榕根提取物能改善小鼠急性酒精肝损伤肝组织病理学变化。结论:琴叶榕根提取物对急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用,且其水提物作用机制可能与焦亡通路相关。

四逆散含药血清对皮质酮损伤PC12细胞钙敏感受体相关作用机制研究

目的探讨四逆散对皮质酮诱导PC12细胞损伤的干预作用是否与钙敏感受体(CaSR)以及细胞凋亡密切相关。方法以四逆散含药血清为干预药物,将PC12细胞分为空白血清组、皮质酮组、2.5%、5%、10%含药血清组,MTT法检测细胞存活率。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法、蛋白免疫印迹技术对细胞凋亡率以及C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、细胞Cytochrome C蛋白进行检测。通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法检测四逆散含药血清联合CaSR激动剂(GdCl3)或CaSR抑制剂(NPS2390)各组细胞的凋亡率。结果与空白血清组比较,皮质酮组存活率、CaSR蛋白表达量降低(P<0.01,P<0.05);皮质酮组凋亡率、C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)以及胞浆Cytochrome C蛋白表达量增加(P<0.01,P<0.05)。与皮质酮组比较,含药血清组存活率增加(P<0.01),5%、10%含药血清组CaSR蛋白表达量及皮质酮+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01,P<0.05);含药血清组、皮质酮+GdCl3组凋亡率降低(P<0.01)和10%含药血清组C-Caspase3、C-Caspase9、Bax(6A7)、胞浆Cytochrome C蛋白表达量降低(P<0.01)。与皮质酮+10%含药血清组比较,皮质酮+10%含药血清+NPS2390组凋亡率增加(P<0.01)。与皮质酮+GdCl3组比较,皮质酮+10%含药血清+GdCl3组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论四逆散含药血清可以抑制皮质酮诱导的PC12细胞凋亡,其作用机制与CaSR有关。