丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的基因组DNA为模板,PCR扩增出转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-trans-glutaminase,pro-TG)),PCR产物连接到pMD18-T克隆载体后亚克隆到表达载体pET-22b(+),转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。重组大肠杆菌经IPTG诱导后,转谷氨酰胺酶酶原(pro-TG)主要以可溶性蛋白表达。菌体离心后用丙酮高速搅拌破碎细胞,亲和层析成功地纯化到了转谷氨酰胺酶酶原。转谷氨酰胺酶酶原经胰蛋白酶切割激活后其酶活为502.8 U/g CDM(菌体干重)。采用BSA交联试验证实成熟的转谷氨酰胺酶(TG)具有功能。采用丙酮破碎法提取重组大肠杆菌表达的转谷氨酰胺酶酶原对大规模工业化生产转谷氨酰胺酶进行了有益的探索。

米曲霉分泌组的预测及分析

利用信号肽分析软件SignalP3.0跨膜结构预测软件Phobius、TMHMMv2.0和THUMBUP,GPI锚定位点预测软件big-PIPredictor,亚细胞蛋白定位软件TargetP1.1,对米曲霉全基因组中的12063个氨基酸序列进行预测。在米曲霉中有1019个分泌蛋白,编码这些蛋白的ORF最小为330bp,最长为5651bp,平均为1370bp。利用LipoP1.0分析预测得到的分泌蛋白中,755个带有I型信号肽酶识别位点,25个带有Ⅱ型信号肽酶识别位点,酶切位点附近氨基酸比较保守。利用TatP1.0对1019个分泌蛋白进行分析,得到43个蛋白序列可能从Tat途径分泌,但是没有找到RR-motif。在1019个分泌蛋白中,497个有功能描述,主要包括各种酶类、能量产生与传递以及自身修复防卫等。

转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌WB800中的表达

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)基因组DNA为模板,PCR扩增得到转谷氨酰胺酶酶原基因(pro-transglutaminase,pro-TG),经pMD18-T载体亚克隆到表达载pBEp43(+),然后转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800中,经过32 h摇瓶发酵,成功表达了转谷氨酰胺酶酶原。采用胰蛋白酶激活转谷氨酰胺酶酶原,成功切除前导肽后得到成熟的转谷氨酰胺酶。牛血清蛋白(BSA)交联表明成熟的转谷氨酰胺酶具有蛋白交联的功能。本研究首次采用枯草芽孢杆菌作为宿主分泌表达了茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶酶原,对基因工程异源表达这种特殊的食品用酶提供了新思路。