CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。

东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3候选基因LOC_Os03g53670-DX在低温胁迫下的表达及克隆

【目的】研究东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS3.3候选基因的功能。【方法】结合课题组前期完成的转录组分析数据,将落在qCTS3.3 QTL区域的东乡野生稻苗期耐冷相关差异表达基因LOCOs03g53670-DX作为qCTS3.3的候选基因,通过实时荧光定量PCR验证不同冷胁迫处理下东乡野生稻中该基因表达情况,并利用RT-PCR技术从东乡野生稻幼苗中扩增LOCOs03g53670-DX的全长cDNA,并进行该基因的过表达载体构建。【结果】测序结果表明:LOCOs03g53670-DX基因的cDNA全长为1 986 bp,共编码661个氨基酸,蛋白分子量为173 ku,理论等电点(pI)为4.92。在线分析软件预测LOCOs03g53670-DX氨基酸序列近C端包含1个高度保守结构域YTH,表明该基因属于RNA结合蛋白。系统进化分析表明:LOCOs03g53670-DX与高粱(XM021447002.1)和菠萝(XM020225621.1)的YTH结构域基因位于同一进化分支上,亲缘关系最近。进一步利用农杆菌介导转化方法,经潮霉素筛选及转基因苗叶片GUS化学染色阳性鉴定,最终得到了转入LOCOs03g53670-DX基因的26株阳性转基因植株。【结论】本研究为后续LOCOs03g53670-DX基因在冷胁迫条件下的功能和作用机制研究奠定材料基础。

水稻LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下表达分析及CRISPR/Cas9定向编辑

为探明LOC_Os10g05490位点冷胁迫条件下的表达特性和耐冷性功能,以耐冷东乡野生稻和冷敏感水稻93-11为试验材料进行了半定量分析,结果表明,LOC_Os10g05490在冷敏感水稻93-11冷处理前后表达丰度相当,而在耐冷东乡野生稻中冷处理后表达丰度下调,这一结果与前期转录组测序(RNA-seq)结果相符,进一步验证了该位点可能与水稻耐冷相关,随后利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对LOC_Os10g05490编码区于同样具有较强耐冷性的粳稻品种台北309中实施定向基因敲除,并成功获得了26株转基因阳性植株。

基于比较转录组的水稻苗期耐冷相关基因BGIOSGA032296 TALEN基因组编辑技术构建

为了挖掘水稻苗期耐冷基因,基于比较转录组分析,参考公共数据库中的基因序列信息设计靶位点,对冷胁迫条件下东乡野生稻苗期下调表达耐冷相关基因BGIOSGA032296进行TALEN基因组编辑技术构建,克隆酶切鉴定和序列比对结果表明,BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296构建成功,利用农杆菌介导法将TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296转入水稻受体品种TP309,获得了17株转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因和Fok I基因特异引物PCR检测,表明获得的转基因植株皆为携带1301TALEN-032296的阳性植株。该研究为水稻BGIOSGA032296基因后续耐冷表型鉴定奠定了前期基础。

生物信息学在基因组学中的应用

随着计算机科学、物理学、数学等与生命科学的相互渗透和交叉,生物信息学愈来愈显示出其重要性,尤其是在抗病基因的研究中。笔者从结构基因组、比较基因组、功能基因组与生物信息学等方面论述了生物信息学在基因组学中的应用。

水稻品种台北309对短期镉胁迫的生理及形态响应

为了解水稻品种台北309在短期镉胁迫下的自我保护机制,本研究对经不同浓度镉离子(0、30、50、80、100 mg/L)处理7日后的水稻品种台北309二至三叶期幼苗生理指标趋势进行了探讨。结果表明:胁迫后各处理组的叶绿素总含量呈现出低浓度时增加,高浓度时减少的特征;叶绿素a/b比例则持续升高,而后当镉离子浓度过高时比例降低;相对电导率、丙二醛含量表现为30 mg/L时减少,后随镉离子浓度增加而增加;脯氨酸含量在镉离子浓度为30 mg/L时降低,而浓度为50 mg/L时突增,后随镉离子浓度增加再次降低。这说明水稻品种台北309可以通过不同的生理应答耐受短期低浓度镉处理,而高浓度镉处理时其生长将受到毒害。

微型月季的组织培养技术研究

微型月季作为一种重要的微型花卉资源具有广阔的市场前景。通过对微型月季组织快繁的相关过程的初步研究,探索了规模化生产的可能性。结果表明:外植体材料的选取以顶芽为最好;离体芽诱导过程中,最适宜的培养基为MS+6-BA0.50mg/L+NAA0.20mg/L;从增殖倍数、芽生长情况等综合因素来看,MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基最适宜微型月季继代增殖培养。

分子生物学技术在百合病毒病害检测中的应用

对百合病毒的分子生物学检测技术作了综合评述,主要有RT-PCR检测技术、核酸杂交技术、基因芯片技术等。目前,常用的分子生物学技术以RT-PCR为主,而基因芯片检测技术是近几年发展起来高效的检测手段并在植物病毒检测上有广泛的应用前景。

稻瘟病菌性别决定基因的研究进展

简要概述了水稻稻瘟病菌的性别决定基因的研究进展,并且对水稻稻瘟病菌的性别决定基因克隆的重要条件及其可能的结构特征进行了分析和探讨。

平卧菊三七组织培养技术研究

该研究以平卧菊三七的叶片为外植体,对影响其愈伤组织诱导及芽分化的相关因素进行了探讨。结果表明,适合平卧菊三七愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+2,4-D 1mg/L;愈伤组织分化出芽的培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.4mg/L。在1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L的培养基配方上生根较好,移栽到不同基质中的组培苗,存活率达100%。

马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析

根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花色苷的积累是相关的。

马铃薯愈伤组织中色素含量与4个花色苷合成相关基因的表达差异

本研究从马铃薯(Solanum tuberosum cv.Chieftain)茎的愈伤组织中分离得到绿色、白色和红色3种愈伤组织,并利用鲜重法和分光光度法分别测量愈伤组织的生长量、叶绿素和花色苷的含量;通过半定量RT-PCR法分析4个花色苷生物合成相关基因的表达差异。结果表明:绿色愈伤组织生长最快,叶绿素含量最高,红色愈伤组织生长最慢,叶绿素含量最低;绿色和白色愈伤组织中几乎不含花色苷,红色愈伤组织中花色苷含量最高,达2.1OD513/mgFW;对CHS、F3H、DFR和F3'5'H四个花色苷生物合成相关基因表达分析发现,绿色和白色愈伤组织不合成花色苷可能与DFR基因不表达有关。本实验结果为进一步阐明花色苷生物合成机理和花色苷色素的生产应用提供一定的理论依据。

二氢黄酮醇-4-还原酶基因的结构与功能研究

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷生物合成途径的关键酶,其基因已从多种植物中克隆出来。从该基因的结构、功能和表达特性等方面进行了总结,为DFR基因的进一步研究和利用提供参考。

不同冷激处理对黄瓜的保鲜效果研究

以宜春市袁州区凤凰市场的黄瓜为实验材料,用控制变量法研究了不同冷激时间对黄瓜保鲜的效果影响。结果表明,冷激时间为20min的处理组的A组,在抑制黄瓜的腐烂系数和控制黄瓜丙二醛含量优于其他处理组;而冷激处理40min的处理B组,在控制黄瓜的相对电导率较为成功,冷激1h的处理组C组在黄瓜的腐烂指数、丙二醛含量以及电导率都与其他两组相差甚远,甚至超过了对照组。综合得出冷激处理时间为20min的A组的保鲜效果最好。

“紫三七”生态适应和药效优越性的评价

评价了"紫三七"在生态适应和药效方面比普通"绿三七"所具备的优越性,并分析其原因。"紫三七"根状茎和绒根的紫色素属于花色苷类,花色苷在三七根状茎和绒根中的积累导致"紫三七"的形成。"文山三七"根状茎和绒根的紫色应是文山州特殊自然条件诱导三七产生的、利于三七生存的进化性状。花色苷的积累并不动摇或否定皂苷是三七最重要活性成分的地位;花色苷本身具备多种药理活性、对皂苷药理活性存在增效和补充作用及花色苷的形成、积累能提高三七总皂苷含量决定了"紫三七"的药效比普通"绿三七"的优越。本文可为三七育种中的早期定向选择提供重要依据,并更新人们关于三七活性成分和药效的传统观念,也将为三七的产品开发开辟一个新领域。

东乡野生稻NBS类抗病基因同源片段的克隆及序列分析

根据已知的NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR扩增及克隆,从东乡野生稻(Dongxiang Oryza rufipogon Griff.)中共获得7个新的NBS-LRR类抗病基因同源片段。所有7个抗病基因同源序列均含有NBS-LRR类抗病基因的保守序列,如P-loop、Kinase 2、Kinase 3a以及跨膜区域等。通过氨基酸同源性比较和分析,发现克隆到的抗病基因同源序列与已克隆的水稻白叶枯抗病基因Xa1的相应氨基酸序列存在约40%的同源性,其中的3个NBS抗病基因同源序列还与小麦抗叶锈病基因Lr1存在40%的同源性。

草莓连作自毒障碍研究综述

草莓是一种多年生草本植物,具有重要的经济价值和社会价值。草莓连作会出现长势变弱、产量降低、品质下降、病虫害严重的障碍现象,即自毒障碍作用。本文主要论述了草莓连作自毒障碍的危害、发生原因和克服措施,并进行了展望。

水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。

红掌组织培养技术研究

对影响红掌愈伤组织诱导及芽分化的几个因素进行了研究。结果表明:同一成熟度的外植体,其叶柄愈伤组织诱导率明显优于叶片和花柄。诱导愈伤组织形成的培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D;芽分化和增殖培养基为MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;生根与增殖同步。

二倍体马铃薯野生种高效再生体系的建立

以二倍体马铃薯野生种(Solanum cardiophyllum)的叶片和茎段为材料,进行离体再生体系的研究。结果表明,叶片和茎段愈伤组织最适诱导培养基分别为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L,平均诱导率分别达93.75%和99.26%;来源于叶和茎段的愈伤组织不定芽分化的最适培养基分别为MS+6-BA3.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+GA32.5 mg/L和MS+6-BA3.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+GA35.0 mg/L,不定芽平均分化率达96.43%和97.25%。生根培养基以MS+NAA0.3 mg/L效果最好,平均生根率达100%。