生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠中的作用与机制研究

目的探讨生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎中的作用与机制,为其临床应用提供理论依据。方法6~8周龄BALB/c小鼠,采用随机数生成器,随机分为对照组、心肌炎组、GHRL-12组和GHRL-12+心肌炎组。GHRL-12组和GHRL-12+心肌炎组小鼠尾静脉注射10 mg/kg GHRL-12连续1周,同时对照组和心肌炎组小鼠尾静脉注射同等体积的无功能scramble肽。在第7天和第14天分别给予心肌炎组和GHRL-12+心肌炎组小鼠250μg心肌肌钙蛋白I(cTnI),从第14天开始,每间隔1天给予小鼠腹腔注射5 mg/kg anti-PD-1,共5次。每7天称量小鼠体重,测量小鼠心体比和心胫比。超声心动图检测心功能指标。HE染色检测心肌组织炎症细胞浸润程度,Masson染色检测心肌组织纤维化程度,并用ImageJ对炎症细胞浸润和纤维化程度进行量化。取小鼠眼球血,检测血清中肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶1(LDH-1)变化。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子cTnI、cTnT、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放情况。蛋白质印迹技术测定小鼠心肌组织中自噬相关蛋白高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、酵母Atg6同源物(Beclin-1)、自噬基因-相关蛋白5(ATG5)和微管相关蛋白轻链3B(LC3B)的表达,同时测定小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达。对心肌细胞核用DAPI染成蓝色,凋亡细胞被TUNEL染成绿色,检测小鼠心肌组织发生凋亡的情况。结果(1)与对照组相比,GHRL-12组小鼠体重无显著差异,心肌炎组小鼠体重增长不明显;与心肌炎组比较,给药第19天起GHRL-12+心肌炎组小鼠体重增长较为明显。与对照组和GHRL-12组相比,心肌炎组小鼠心体比、心胫比显著增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心体比、心胫比下降。(2)超声心动图显示,单纯给予GHRL-12干预对小鼠心功能无显著影响,与对照组相比,心肌炎组小鼠左心室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)显著下降,左心室收缩末期内径(LVEDs)、左心室舒张末期内径(LVEDd)显著增加;而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠LVEF、FS升高,LVEDs、LVEDd减少。(3)HE染色结果显示,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠炎症细胞浸润显著增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠炎症细胞浸润减少。(4)Masson染色结果表明,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠心肌组织纤维化程度增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织纤维化程度降低。(5)与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠血清中CK、CK-MB、LDH-1、cTnI和cTnT均显著上升,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组均显著下降。(6)蛋白质印迹结果显示,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠心肌组织HMGB1、Beclin-1、ATG5和LC3B蛋白表达均显著增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组均显著下降;同时,心肌炎组Caspase-3和PARP蛋白表达均显著增加,GHRL-12+心肌炎组均显著减少。(7)TUNEL结果显示,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠心肌组织凋亡显著增加,与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织凋亡显著下降。结论多肽GHRL-12能够改善免疫检查点抑制剂诱导的心功能损伤,减少心肌组织中炎症细胞浸润和纤维化,抑制心肌组织凋亡和自噬,为未来免疫检查点抑制剂相关心肌炎的治疗提供潜在可能。

四种心脏保护药物对小鼠阿霉素诱导的心脏毒性的不同预防作用

背景与目的:阿霉素又称多柔比星,是一种广泛使用的蒽环类抗肿瘤药物,但以扩张型心肌病和充血性心力衰竭为典型表现的心脏毒性限制了其更为广泛的临床应用。本研究旨在比较高血压、高脂血症和心肌病的常用心脏保护药物贝那普利、阿托伐他汀、沙库巴曲缬沙坦和卡维地洛对阿霉素诱导的心肌病的保护作用并初步探索其潜在机制。方法:将成年雄性C57BL/6小鼠分为:生理盐水组、阿霉素组、阿霉素+阿托伐他汀组(atorvastatin)、阿霉素+贝那普利组(benazepril)、阿霉素+沙库巴曲缬沙坦组(sacubitril/valsartan)和阿霉素+卡维地洛组(carvedilol)。除生理盐水组外,予腹膜内注射阿霉素溶液(每周4 mg/kg)共5周,建立阿霉素诱导的体内心肌病模型。各组每日分别予阿托伐他汀10 mg/kg、贝那普利10 mg/kg、沙库巴曲缬沙坦60 mg/kg(沙库巴曲28.8mg/kg,缬沙坦31.2 mg/kg)和卡维地洛5 mg/kg,以每日每只0.2mL的剂量灌胃预处理共6周。进行各组二维超声心动图、细胞凋亡、纤维化和炎症等分析。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测心肌细胞中总mRNA,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测Bax和Bcl-2的表达水平。在4T1乳腺肿瘤细胞接种的BALB/c小鼠中,对以上不同的心脏保护药物进行治疗前后肿瘤体积和质量予以记录,评估心脏保护药物应用对肿瘤生长的影响。结果:这些心脏保护药物都有效地抑制了阿霉素引起的左心室功能障碍,改善了阿霉素相关的组织病理损伤,并皆能抑制阿霉素诱导的细胞凋亡和调节Bcl-2和Bax蛋白的表达,减少心肌细胞中阿霉素介导的促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的积累。与其他3种药物相比,沙库巴曲缬沙坦能显著提高左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)(65.1%±3.8%vs 63.5%±4.6%,61.6%±4.1%,62.1%±5.2%,P<0.05)和缩短分数(fractional shortening,FS)(34.2%±3.7%、33.9%±3.3%、32.6%±2.8%和33.0%±3.6%,P<0.05),减轻心脏纤维化;贝那普利和沙库巴曲缬沙坦在限制心脏大小、心脏与胫骨长度之比(heart weight to tibia length,HW/TL)和保持心肌细胞横截面积(cardiomyocyte cross-sectional area,CSA)方面具有明显的效果;阿托伐他汀兼具中等水平的抗凋亡以及抗炎功效;卡维地洛的抗炎作用为4种药物之首。结论:本研究比较了不同药物对阿霉素诱导的心肌病的保护作用并初步探索了潜在机制。未来大规模临床研究可进一步探索患者层面不同心脏保护药物缓解阿霉素诱导的心脏毒性的潜能。

实时三维超声心动图评估高剂量蒽环类药物化疗后左心室形态及收缩同步性的临床研究:5年回顾性随访

目的:运用实时三维超声心动图(real-time three-dimensional echocardiography,RT-3DE)和三维斑点追踪成像技术(three-dimensional speckle tracking imaging,3D-STI)评价蒽环类药物化疗对长期生存弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell non-Hodgkin lymphoma,DLBCL)患者左心室(左室)形态及收缩同步性的影响,为评价高、低剂量蒽环类药物的心脏毒性提供影像学证据。方法:选择长期生存的DLBCL患者20例(病例组)及36例年龄、性别匹配的健康人(对照组)。20例DLBCL患者中55%为男性,末次蒽环类药物治疗后平均随访年限为(4.8±1.0)年。根据接受蒽环类药物的累计剂量,将病例组分为高剂量组(n=15,>360 mg/m2)和低剂量组(n=5,≤360 mg/m2)。所有研究对象均行二维超声心动图和RT-3DE,行3D-STI评估左室整体纵向应变(global longitudinal strain,GLS)、整体圆周应变(global circumferential strain,GCS)、扭转和扭转力矩。左室收缩不同步指数(systolic dyssynchrony index,SDI)以经RR间期校正后的16节段达最小收缩容积离散度表示。结果:与对照组相比,病例组三维左室射血分数[LVEF,(60.0±7.9)%vs(63.2±2.3)%,P=0.02]、GLS[(-17.6±3.4)%vs(-22.3±3.0)%,P<0.01]、GCS[(-28.4±6.0)%vs(-31.5±2.7)%,P=0.01]均显著降低,舒张末期左室容积明显缩小[(73.8±18.4)mL vs(92.0±26.2)mL,P=0.01]。病例组左室3D-SDI参数大于对照组(P<0.01)。与低剂量组相比,高剂量组16节段达最小容积时间最大差值占心动周期的百分率[Tmsv16-Dif%;20.83%(15.09%,49.71%)vs 13.75%(7.10%,15.26%),P=0.02]显著增大;而两亚组患者3D-STI应变参数差异无统计学意义。结论:RT-3DE是评价蒽环类药物治疗后肿瘤长期生存者左室收缩功能障碍和收缩不同步化改变敏感且有效的手段,其Tmsv16-Dif%可用于进一步识别高剂量蒽环类药物对肿瘤生存者心脏收缩同步性的损伤。

程序性死亡[蛋白]-1抑制剂诱导小鼠心肌炎模型的建立

背景与目的:程序性死亡[蛋白]-1(programmed death-1,PD-1)抑制剂诱发的心肌炎亟待通过动物模型探究治疗靶点。本研究旨在探索此类自身免疫性心肌炎小鼠模型的最佳造模方法。方法:选取6周龄健康雄性BALB/c小鼠30只,分别编号并随机分为对照组(control组)、自身免疫性心肌炎组(TnⅠ组)和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)相关心肌炎组(TnⅠ+anti-PD-1组),每组10只。除control组外,分别于第1、7天给小鼠皮下注射0.1 mL含有0.25 mg小鼠心肌TnⅠ肽段的完全弗氏佐剂。TnⅠ+anti-PD-1组自第7天起,每次5 mg/kg腹腔注射PD-1抑制剂,每2 d给药1次,共5次,累积剂量25 mg/kg。观察小鼠的一般状态、死亡率、心脏指数、超声心动图、心肌病理学改变、血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)及CK同工酶(CK isoenzyme,CK-MB)水平。结果:与control组相比,造模第21、56天,TnⅠ和TnⅠ+anti-PD-1组体重均显著下降(P<0.05,P<0.01),两组间体重有显著差异(P<0.05),进食量均显著下降(P<0.05,P<0.01)。两组的死亡率在第21天分别为0%和10%,在第56天分别为10%和20%。第56天,TnⅠ组心脏指数未显著增加(P>0.05),TnⅠ+anti-PD-1组显著增加(P<0.05),且左心室射血分数(ejection fraction,EF)显著下降(P<0.001)。急性心肌炎期,TnⅠ组心外膜下见少量炎症细胞浸润,TnⅠ+anti-PD-1组心外膜下见大量炎症细胞浸润,心肌细胞坏死。扩张型心肌病期,TnⅠ组炎症细胞浸润减少,心肌细胞轻度边界不清、空泡化,TnⅠ+anti-PD-1组细胞坏死、空泡化、核异形更显著。第56天,TnⅠ+anti-PD-1组血清CK、CK-MB显著升高(P<0.001),且较TnⅠ组升高更明显(CK:P<0.01;CK-MB:P<0.05)。结论:建立了PD-1抑制剂诱导的、低死亡率的小鼠心肌炎模型,以心肌急慢性自身免疫炎性改变、左心室EF下降、心肌酶谱升高为突出特征。设计合成了特殊的小鼠心肌TnⅠ肽段,强化了PD-1抑制剂的造模效果。

中性粒细胞外陷阱在治疗程序性细胞死亡受体-1抑制剂相关心肌炎中的作用研究

目的研究中性粒细胞外陷阱(NETs)在程序性细胞死亡受体-1(PD-1)抑制剂相关心肌炎中的作用,探索靶向NETs的免疫检查点抑制剂相关心肌炎(ICIAM)治疗靶点。方法选6周龄健康雄性BALB/c小鼠30只,分别编号并随机分为对照组(n=10)、模型组(n=10)和治疗组(n=10)。除对照组外,分别于第1和7天给小鼠皮下注射100μl含有250μg小鼠心肌肌钙蛋白I(TnI)肽段的弗氏完全佐剂(CFA)。第8天起每2天腹腔注射一次PD-1抑制剂(15μg/只),共5次。PF-1355治疗组从造模开始前1天起连续16 d腹腔注射PF-1355(50 mg·kg^(-1)·d^(-1))。观察各组小鼠一般状态,实时荧光定量聚合酶链式反应(RTFQ-PCR)评估中性粒细胞相关趋化因子、NETs和焦亡相关因子、促炎细胞因子的转录水平调控,免疫组化、免疫荧光检测和蛋白质印迹法反映焦亡相关分子的蛋白水平变化,超声心动图展示主要心功能指标改变,心肌病理对比炎性浸润程度。结果模型组小鼠较对照组小鼠心肌NETs免疫荧光强度明显增加(2.49±0.08和0.99±0.26,P<0.001)。模型组心肌组织焦亡相关NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-Caspase 1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase 1)、剪切的Gasdermin-D(cleaved-GSDMD)、Gasdermin-D(GSDMD)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的蛋白表达水平较对照组上调(均P<0.05)。PF-1355治疗后,相比于模型组,治疗组小鼠左心室射血分数(LVEF)(73.58%±5.31%和58.12%±3.19%,P<0.001)、左室缩短分数(LVFS)(39.78%±4.31%和33.89%±2.19%,P<0.001)升高;苏木精-伊红染色结果显示与模型组相比,治疗组炎性浸润面积百分比减少(30.12%±3.57%和14.92%±2.46%,P<0.001);治疗组免疫荧光NETs生成较模型组减少(2.52±0.04和1.03±0.05,P<0.001);治疗组NLRP3等焦亡相关分子水平较模型组下调(均P<0.05)。结论在PD-1抑制剂相关的心肌炎中,NETs通过激活NLRP3炎症小体导致心肌细胞焦亡。特异性髓过氧化物酶抑制剂PF-1355通过调控NETs来下调NLRP3炎症小体激活,可能进一步挽救和逆转NETs介导的心肌焦亡损伤。

左房室整体纵向应变评价蒽环类化疗药物治疗后左心功能早期变化

目的评价三维斑点追踪超声心动图(3D-STE)应变指标评估蒽环类药物化疗早期左心功能改变的价值。方法本研究为回顾性研究。选取2012年12月至2014年12月于复旦大学附属肿瘤医院接受以蒽环类药物为基础的化疗方案治疗的弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)患者37例。分别于化疗前、化疗2周期后及化疗结束后行3D-STE检查。应用TTA工作站分析患者的超声心动图图像,测量指标包括左心房最小容积(LAVmin)、左心房排空指数(LAEF)、左心房主动排空指数(LAAEF)等左心容积指标,及左心室整体纵向应变(LVGLS)、左心室整体环向应变(LVGCS)、左心房整体纵向应变(LAGLS)等左心应变指标。计算LVGLS与LAGLS的绝对值之和得出左房室整体纵向应变(LAVGLS)。观察纳入患者不同时间点3D-STE测量的左心应变指标变化情况。结果本研究共纳入37例DLBCL患者,年龄(48.3±12.1)岁,其中男性23例(63.9%)。与基线测量值相比,患者化疗2周期后及化疗结束时LVGLS[化疗2周期后:(-18.63±4.73)%比(-22.13±4.40)%,P=0.001;化疗结束:(-18.26±4.64)%比(-22.13±4.40)%,P<0.001]、LAGLS[化疗2周期后:(20.41±5.56)%比(23.98±5.59)%,P=0.003;化疗结束:(17.60±3.96)%比(23.98±5.59)%,P<0.001]和LAVGLS[化疗2周期后:(39.05±7.60)%比(46.11±7.77)%,P<0.001;化疗结束:(40.34±8.55)%比(46.11±7.77)%,P<0.001]均降低;LVGCS[(-21.98±5.82)%比(-26.15±7.51)%,P=0.010]、LAVmin[(23.93±7.29)ml比(20.33±7.03)ml,P=0.029]、LAEF[(28.94±11.16)%比(35.79±11.12)%,P=0.002]、LAAEF[(11.93±10.00)%比(18.10±9.96)%,P=0.013]仅在化疗结束后改变,而在化疗2周期后无明显变化(P均>0.05)。结论3D-STE左心应变指标能发现蒽环类药物化疗早期心肌功能改变,可为化疗过程中的心肌毒性监测提供更加敏感的指标。