氧化酚砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的研究

目的：了解氧化酚砷（phenylarsineoxide,PAO）对急性早幼粒细胞性白血病（APL）细胞系NB4细胞的可能作用。方法：在台盼蓝排除法计数活细胞和细胞活力的基础上，通过细胞形态学和流式细胞仪检测细胞凋亡。通过对细胞进行Rhodamine（Rh）123和碘化丙啶双重染色，并应用流式细胞仪检测其荧光强度，以反映细胞线粒体跨膜电位（△Ψm）。结果和结论：低浓度（005和0．1μmol／L）的PAO明显抑制NB4细胞的生长，并显著降低其细胞活力。进一步地，细胞形态学观察和流式细胞仪分析显示，这些浓度的PAO诱导NB4细胞凋亡。该效应可能与△Ψm下降密切相关。

大肠杆菌pheA基因在黄色短杆菌中的克隆与表达

在大肠杆菌中，影响苯丙氨酸生物合成的关键酶基因之一是ｐｈｅＡ基因。利用大肠杆菌棒状杆菌穿梭表达载体ｐＬＣＸ３６克隆了一个对反馈抑制不敏感的大肠杆菌基因ｐｈｅＡ，组建成质粒ｐＬＣＸ３７。ｐＬＣＸ３７以接合转移方法转移到抗氟代苯丙氨酸的黄色短杆菌３６２１等菌株中，获得若干基因工程菌株。经发酵测定，编号为３６２１０９的黄色短杆菌的苯丙氨酸产量比出发菌３６２１高出１倍。最高达２６２６ｍｇ／ｍｌ。

穿梭表达载体的构建及产L-苯丙氨酸基因工程菌的选育

基因工程技术已经给发酵工程的发展注入了新的活力,使传统的发酵工业面貌一新。它不仅开创了许许多多新的发酵产品,而且也使不少传统发酵产品的产量、质量和生产技术有了新的飞跃。棒状杆菌中许多菌(如,谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌)是重要的工业生产菌。这类菌生长迅速、不产胞外蛋白酶、无内毒素、产品易分离纯化,已广泛用于各种氨基酸、核苷酸等的发酵生产。因此开展棒状杆菌的基因工程研究具有重要的理论意义和应用价值。

大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的Ｐ。启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，使表达菌体的蛋白抽提物中ＣＭ／ＰＤ和ＰＡＴ的比活分别提高了１４．１倍／７．９倍和３．５倍．当ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ以ｔｙｒＢ－ｐｈｅＡ的形式进行串联表达时，酶的比活分别提高了４．２倍／２．４倍和２．５倍；而以ｐｈｅＡ－ｔｙｒＢ的形式串联表达时，三种酶的比活分别提高了１７．５倍／８．７倍和３．３倍．结果表明，后一种串联方式的表达效果较好．