人骨髓间充质干细胞的体外培养及诱导分化

目的建立一株能在体外长期培养并具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞(HBMSC).方法利用差异贴壁法从人肋骨中分离纯化HBMSC,在体外通过地塞米松、胰岛素诱导分化为脂肪细胞,用VitC、β-磷酸甘油、地塞米松诱导下可分化成骨细胞,裸鼠体内分化为软骨样细胞及成骨样组织,采用流式细胞仪检测细胞表面CD31、CD34、CD45、CD9、CD90、CD105和CD106.以2.5×107细胞接种于裸鼠皮下进行致瘤实验,用DY-NALREU-SSO反向杂交法检测HLA.结果细胞已连续培养超过30代仍能稳定生长,细胞表面特性为CD105、CD106阳性,而CD31、CD34、CD45、CD9、CD90为阴性.在体外能诱导成脂肪细胞、成骨细胞.无致瘤性,在裸鼠体内能形成软骨细胞及骨样组织.结论培养了一株能在体外长期培养及具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞.

肺癌患者外周血循环中癌细胞的流式细胞仪分析

目的 用流式细胞仪分析肺癌患者外周血循环中的癌细胞。方法 外周血经Ficoll梯度离心分离单核细胞组分 ,后者用CD45、细胞角蛋白 (CK)及肺癌特异性抗体 (2F7/S5A)染色后 ,应用流式细胞仪检测CD45 -CK+2F7/S5A+细胞。结果 检测了 16 5例肺癌患者外周血 ,发现 5 0例 (30 .30 % )患者外周血癌细胞呈阳性。其中非小细胞肺癌阳性率为 30 .6 7% (45 / 15 0 ) ,小细胞肺癌为 33 .33 %。阳性率与患者的病理分期有显著相关性 (P <0 .0 5 )。结论 利用流式细胞仪分析检测肺癌患者外周血循环中的癌细胞不仅有助于临床病理分期 ,而且对预测肺癌转移潜能具有应用价值。

不饱和脂肪酸对肺癌细胞的抑制作用

不饱和脂肪酸（ＬＡ）浓度为２５μｈ／ｍｌ，对人肺腺癌细胞系（ＳＰＣ－Ａ１）细胞和二倍体人胚肺细胞系（ＨＬＦ）细胞抑制率分别为：９８．４±２．２％，１８．０±２．１％（Ｐ＜０．００１）。表现为对恶性细胞的选择性抑制作用。ＳＰＣ－Ａ１对５μｇ／ｍｌＬＡ无反应，１μＭ丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）对ＳＰＣ－Ａ１细胞抑制率为４３．４±２．９％而当用１μＭＭＭＣ处理这种对５μｇ／ｍｌＬＡ无反应的ＳＰＣ－Ａ１时，抑制率提高到６５．２±５．６％（Ｐ＜０．００１）表明低浓度ＬＡ能提高ＳＰＣ－Ａｌ细胞对ＭＭＣ的敏感性。

应用差异凝胶电泳及质谱技术筛选肺癌患者血浆差异蛋白

目的建立健康者、肺部炎症患者和肺癌患者的血浆蛋白表达谱,寻找与肺癌早期发生相关的差异蛋白。方法应用差异凝胶电泳(DIGE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对健康者、肺部炎症患者和Ⅰ期肺癌患者血浆进行蛋白质组学比较研究,寻找肺癌相关差异蛋白。结果应用DIGE进行分离后,成功获得了蛋白质组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱;DeCyder 6.5软件分析获得差异大于2倍的蛋白质点共有72个;质谱鉴定去冗余后确定了12种蛋白质,其中7种与肿瘤相关,分别为酰基辅酶A合成酶家族成员3、抗血小板膜糖蛋白Ⅰb特异性抗体、γ-纤维蛋白原、4型血清淀粉样蛋白A、补体因子H、钙结合微丝蛋白、载脂蛋白Ⅰ。结论应用DIGE及MALDI-TOF-MS分离并初步鉴定了12种蛋白质,筛选出7种在肺癌患者血浆中高表达的肿瘤相关蛋白。

耐紫杉醇肺癌细胞BNX动物模型的建立

目的建立一种耐药性稳定的人肺癌BNX小鼠皮下移植瘤模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础。方法将体外培养的对数生长期的肺癌耐药细胞株A549-Taxol,接种在免疫缺陷小鼠的皮下,形成肿瘤,采用肿瘤组织块或肿瘤组织原代培养的细胞,分别于动物皮下接种致瘤;体内外交叉进行致瘤,提高耐药细胞株A549-Taxol的致瘤率和缩短致瘤时间。通过免疫组化鉴定该耐药细胞的特性。用MTT法检测细胞的耐药指数。结果耐药细胞接种于SCID小鼠4个月后在皮下形成肿瘤灶。用该肿瘤组织块或细胞悬液移植于SCID小鼠,通过反复3次后,细胞生长速度变快,2个月后皮下即可形成肿瘤。将该细胞移植于BNX小鼠,以同样的方法将瘤组织体内外交叉进行致瘤,最终BNX小鼠种植成功率达到80%。致瘤时间为3周。耐药细胞和组织块P-gp170、GST-π和MMP-7均高表达。A549-Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代A549细胞的520倍。结论初步建立了人肺腺癌耐药细胞(A549-Taxol)的动物模型,为肺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台。

蛋白质指纹图谱技术在肺癌分子标志物研究中的应用

目的分析肺癌与肺部良性疾病及正常人血浆蛋白质指纹图谱的变化,建立肺癌血浆标志物诊断模型。方法应用蛋白质指纹图谱(SELDI-TOF-Ms)技术检测108例肺癌患者、40例肺部良性疾病患者和22例正常人血浆标本,采用层次聚类分析和主成分分析建立决策树模型,应用该模型盲筛21例肺部良性疾病和47例Ⅰ期肺癌。结果筛选到23个差异蛋白峰(P<0.001)。盲筛分析显示决策树模型诊断敏感性和特异性分别为72.34%和71.43%,阳性预测值和阴性预测值分别为85.0%和78.95%,诊断正确性为72.06%。结论应用SELDI-TOF-Ms技术初步建立的蛋白质模型为肺癌的早期诊断提供了新的技术平台。

外源MDR-1基因对小鼠肺腺癌细胞耐药性产生的影响及机理研究

目的 了解MDR 1基因表达与肺癌细胞耐药性的关系。方法 用FUGENTM6转染试剂将MDR 1基因导入小鼠Lewis肺腺癌细胞株 ( 3LL) ,建立了耐药细胞株 ( 3LL MDR 1)。用MTT方法测定细胞耐药性并观察异搏定对耐药的逆转效应 ,MDR 1基因表达产物P gp采用免疫组化方法观察 ,应用流式细胞仪分析其对示踪剂罗丹明1 2 3的摄取与排泄。结果 建立了一株能稳定表达P gp和对长春生物碱类、鬼臼毒素类具有显著耐药性的细胞株。免疫组化证实耐药细胞高度表达P gp糖蛋白。异搏定能部分逆转该细胞株的耐药性 ,且效应随着剂量递增 ,流式细胞仪测定显示耐药细胞对示踪剂的排泄作用显著高于亲代细胞。结论 通过基因转染实验 ,证明MDR

人骨髓间充质干细胞向骨骼肌定向分化的研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞在裸鼠损伤腿部向骨骼肌定向分化。方法 在裸鼠腿部注入无水酒精造成肌肉损伤 ,取培养人骨髓间充质干细胞用荧光染料Dil标记后注入损伤处 ,术后 6d及 12d取损伤部肌肉进行形态观察和免疫荧光标记。结果 在术后 6d可见Dil标记细胞向骨骼肌分化 ,Myoglobin阳性表达。术后12d后可见新生骨骼肌出现典型横纹 ,细胞核MyoD1阳性表达。 结论 在裸鼠损伤肌肉的微环境中 ,人骨髓间充质干细胞可向骨骼肌定向分化 。

骨髓间质干细胞移植对心肌梗死后细胞凋亡的影响

目的研究骨髓间质干细胞移植于SD大鼠急性心肌梗死后对心肌细胞凋亡的影响。方法SD大鼠开胸结扎前降支中段30min后，实验组在心肌缺血区域注射Dill标记的骨髓间质干细胞3×100个，对照组以100μL生理盐水作心肌缺血区域注射。4～6周后取心脏组织切片，采用TUNEL法和免疫组织化学技术进行心肌细胞凋亡的原位检测，以及肌钙蛋白T（Troponin T）、Connexin 43、血管内皮生长因子（VEGF）、因子Ⅷ检测。结果对照组的心肌细胞凋亡指数为225．28±125．41，显著高于实验组的78．57±40．29（P〈0．05）。两组Troponin T和Connexin 43均为阴性。实验组的VEGF和因子Ⅷ呈阳性表达。结论骨髓间质干细胞移植对心肌梗死后促进VEGF分泌和因子Ⅷ表达，可减少心肌细胞凋亡，改善心脏功能。

抗人肺腺癌单克隆抗体与蓖麻霉素A链交联物的抗癌活性

抗肿瘤单克隆抗体与毒素的结合物——免疫毒素,也称免疫导向毒素,既有单克隆抗体的识别功能,又有毒素的杀伤功能,并且能专一性地杀伤靶瘤细胞,不损伤正常细胞。本文报道了IgM型抗人肺腺癌单克隆抗体(LAC_(122))与蓖麻毒素A链(RTA)交联后,在体外对瘤或非瘤靶细胞的细胞毒性作用,和对荷SPC-A瘤裸鼠模型的实验洽疗。

抗人肺腺癌细胞系SPC—A_1单克隆抗体与蓖麻毒素A链交联物的体内体外抗肿瘤活性研究

本文报告了抗人肺腺癌细胞系SPC—A_1单克隆抗体LAC_(122)为IgM型免疫球蛋白,经与蓖麻毒素A链联接后形成免疫毒素IgM—RIA,以SPC—A_1细胞和正常人血白细胞为靶细胞,用ELISA法测定,IgM—RIA的免疫活性较联接前的LAC_(122)仅有轻微下降,但与正常人血白细胞比较。

双黄升白颗粒对化疗所致骨髓抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠细胞周期的双重调控作用及其机制

目的:探讨双黄升白颗粒对化疗所致骨髓抑制荷瘤小鼠骨髓和肿瘤细胞周期双重调控的作用机制。方法:本研究采用Lewis肺癌荷瘤小鼠,30只小鼠随机分为空白组、模型组和治疗组。除空白组外,腹腔注射环磷酰胺制作骨髓抑制模型。治疗组用40g/(kg.d)双黄升白颗粒治疗6d后,流式细胞仪检测细胞周期情况,并计算增殖指数(proliferationindex,PI);蛋白印迹法和免疫组织化学法检测骨髓及肿瘤组织中细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase4,CDK4)、细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent ki-nase6,CDK6)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达。结果:模型组骨髓及肿瘤的G0/G1期细胞比例均低于空白组(P<0.05),PI和CDK4、CDK6、cyclin D1表达高于空白组(P<0.05)。治疗组骨髓G0/G1期细胞比例低于模型组及空白组,PI及CDK4、CDK6、cyclinD1表达均高于模型组及空白组;肿瘤组织G0/G1期细胞比例高于模型组及空白组,PI及CDK4、CDK6、cyc-lin D1表达均低于模型组及空白组。结论:双黄升白颗粒对骨髓抑制Lewis肺癌荷瘤鼠的细胞周期具有双重调控作用,其机制可能与双重调节cyclin D1、CDK4和CDK6表达有关。

ERCC1、RRM1和p53表达与Ⅰ-Ⅱ期肺癌术后预后相关性分析

背景与目的顺铂是肺癌化疗的基础药物,而ERCC1、RRM1、p53表达水平与铂类耐药和预后有关,本研究分析Ⅰ-Ⅱ期NSCLC的ERCC1、RRM1、p53表达与术后生存期的关系,探讨它们与患者预后及与顺铂耐药的相关性。方法收集1992年2月-l994年1月有随访的75例Ⅰ-Ⅱ期NSCLC术后患者,Ⅰ期术后随机分成不化疗组和化疗组,Ⅱ期术后均作化疗,化疗采用以DDP为基础的方案。免疫组化法检测手术标本的ERCC1、RRM1、p53表达,并进行统计分析。结果Ⅰ期ERCC1高表达患者预后明显好于ERCC1低表达,1、3、5年生存率分别为100.00%、91.30%、86.74%和96.43%、60.71%、57.14%(P=0.0058)。Ⅰ期不化疗组ERCC1高表达者生存情况优于ERCC1低表达,中位生存期(MST)分别为72.00+个月和64.67个月(P=0.0327)。Ⅱ期与Ⅰ期相反,ERCC1低表达者预后好,ERCC1低表达者的MST为60.00+个月,而高表达者仅为25.50个月(P=0.0442)。RRM1、p53表达与术后生存率无关。结论ERCC1高表达是Ⅰ期NSCLC术后预后良好的独立指标;含DDP化疗延长了Ⅱ期ERCC1低表达患者的生存,术后可根据ERCC1的水平决定是否选用含DDP化疗;ERCC1表达对NSCLC术后生存期的影响在Ⅰ期和Ⅱ期DDP化疗患者中可能不尽相同,ERCC1高表达在Ⅰ期NSCLC术后展现的是其保护的一面,而Ⅱ期以化疗抵抗为主。

肺癌患者血浆中血管内皮生长因子与碱性纤维母细胞生长因子表达

目的 研究血管内皮生长因子 (VEGF)与碱性纤维母细胞生长因子 (bFGF)在肺癌患者血浆中表达水平。方法 采用定量免疫酶标 (ELISA)方法 ,检测 92例肺癌患者及肺部良性疾病血浆中VEGF与bFGF的含量。结果 84例肺癌与 7例肺部良性疾病血浆中VEGF含量分别为 2 0 1.5± 183.0pg/ml,10 2 .5± 6 2 .5pg/ml,两者差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;其中 4 4例腺癌和 7例小细胞癌的VEGF含量分别为 2 0 2 .3± 177.0pg/ml、381.4± 314 .3pg/ml,与其肺部良性疾病比较 ,差异均有显著性 (分别为P <0 .0 5、P <0 .0 0 1)。在 5 6例肺癌与 4例肺部良性疾病血浆中bFGF含量分别为 4 5 .4± 2 3.9pg/ml,5 0 .4± 2 7.2pg/ml,两者差异无显著性。结论 在肺癌患者血浆中VEGF的含量明显高于肺部良性疾病的含量 ,其中腺癌和小细胞肺癌差异有显著性。

七叶灵方诱导裸鼠人肺腺癌A549移植瘤细胞凋亡的实验研究

目的 :研究中药复方七叶灵方诱导人肺腺癌A5 4 9细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的作用。方法 : 皮下接种人肺腺癌A5 4 9细胞 ,建立裸鼠移植瘤模型 ,随机分为不用任何治疗的对照组 (A组 )、化疗组 (B组 )、化疗加七叶灵治疗组 (C组 )和七叶灵治疗组 (D组 ) ,每组 12只 ,分别给予相应处理。治疗开始后每周测量肿瘤体积并换算成瘤重。采用原位细胞凋亡检测试剂盒 ,检测瘤组织凋亡细胞数。结果 :A组瘤重显著高于其他各组 (P <0 .0 5 ) ,C组、D组与B组比较亦有显著差异 (P <0 .0 5 )。凋亡细胞数各组间具有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,D组瘤组织中的凋亡细胞数显著高于B组和C组 (P <0 .0 5 )。A组则表现出早期细胞为高分化 ,到后期肿瘤组织坏死及部分细胞凋亡。结论 :在裸鼠体内中药七叶灵方具有诱导A5 4

阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血清sRAGE和esRAGE水平的影响

目的探讨阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血清可溶性晚期糖基化终产物受体(SRAGE)和内源性分泌型晚期糖基化终产物受体(esRAGE)水平的影响。方法不稳定性心绞痛患者40例(UA组),给予阿托伐他汀20 mg口服,每日1次,于治疗前和治疗后3个月分别采集静脉血,测量血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、血糖、糖化血红蛋白(HbA1C)、sRAGE及esRAGE水平。另选择20名年龄、性别相匹配的健康体检者作为正常对照组。结果治疗前,UA组的TC和LDL-C水平显著高于正常对照组(P<0.05),sRAGE和esRAGE水平显著低于正常对照组(P<0.05,P<0.01),两组其他指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。经阿托伐他汀治疗3个月后,UA组患者的血糖和HbA1C水平无明显变化(P>0.05),但TC和LDL-C水平明显低于治疗前(P<0.05),sRAGE和esRAGE水平明显高于治疗前(P<0.05);直线相关分析显示,esRAGE水平与LDL-C浓度呈负相关(r=-0.36,P=0.01)。结论他汀类药物具有多效性,阿托伐他汀能升高不稳定性心绞痛患者血清sRAGE和esRAGE水平。

外周血循环中肺癌细胞的流式细胞仪定量分析

目的 运用流式细胞仪定量分析外周血循环中肺癌细胞。方法 外周血经Ficoll梯度离心分离单核细胞组分,后者用CD45、细胞角蛋白(CK)及肺癌特异性单抗(2F7/S5A)染色后,应用流式细胞仪检测CD45- CK+ 2F7/S5A+ 细胞。然后计算每升血中上述细胞含量。结果 (1)外周血单核细胞的表型为CD45+ CK- 2F7/S5A- ,而小细胞和非小细胞肺癌细胞系均为CD45- CK+ 2F7/S5A+ 。因此,应用此方法能从106 白细胞中检测到1个肺癌细胞,敏感性达到每毫升血中检测到5 个肺癌细胞;(2)15 例正常人及7 例肺部良性疾患外周血中CD45- CK+ 2F7/S5A+ 细胞均为阴性,而40例肺癌患者外周血14 例发现阳性细胞,阳性率达35 % ,阳性细胞含量平均为1×105 /L。结论 本方法具有较好的敏感性和特异性。

ERCC1表达与Ⅰ-ⅢA NSCLC患者术后生存及顺铂耐药的相关性

目的分析Ⅰ-ⅢA期非小细胞肺癌（NSCLC）的切除修复交叉互补组1（ERCC1）表达水平与患者术后生存期的关系，探讨ERCC1表达与患者预后及顺铂耐药的相关性。方法收集1992年2月～1994年1月及2002～2005年经根治性手术并获长期随访的152例Ⅰ-ⅢA期NSCLC患者的临床资料。Ⅰ期NSCLC患者术后随机分成不化疗组和化疗组；Ⅱ、ⅢA期术后均采用以顺铂为主的联合化疗方案。免疫组化法检测所有肿瘤组织标本的ERCCl表达。Kaplan—Meier法计算生存率，Log—rank检验比较差异性，并行Cox模型多因素分析。结景I期NSCLC患者ERCC1高表达者，不论化疗与否其预后都明显好于ERCCl低表达者。其中ERCC1高表达组1、3、5年生存率分别为100．00％、9t．30％、86．74％，低表达组则为96．43％、60．71％、57．14％（P=0．0058）。不同于Ⅰ期NSCLC，Ⅱ～ⅢA期NSCLC术后化疗患者ERCC低表达则有较好预后。其中Ⅱ期ERCC1低表达者中位生存期（MST）为60．0＋月，而高表达者仅为25．5月（P=0．0442）；ⅢA期ERCC1低表达组MST为41个月，高表达组仅为24个月（P=0．0203）。结论ERCC1表达对Ⅰ-ⅢANSCLC术后患者生存的影响存在双相效应。在Ⅰ期NSCLC中，ERCC1高表达是预后良好的独立指标；而对Ⅱ-ⅢA期NSCLC术后化疗患者，ERCC1高表达更多体现的是对铂类耐药；故采用铂类为基础的辅助化疗可能将无助提高术后长期生存。

非小细胞肺癌中蛋白激酶C-α的表达及其意义

目的:探讨蛋白激酶C-α(protein kinase C-α,PKC-α)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及细胞株中表达的意义。方法:应用免疫组织化学SP方法检测NSCLC组织芯片中PKC-α蛋白的表达,其中肿瘤组织160例,癌旁组织40例,Ⅰ期91例,Ⅱ～Ⅲ期69例;应用反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测NSCLC细胞株A549、耐顺铂A549(A549-DDP)、H460及H1299等细胞株中PKC-αmRNA的表达;应用Western印迹法检测上述细胞株中PKC-α蛋白的表达。结果:PKC-α蛋白在160例NSCLC组织中的表达率为53.1%(85/160),癌旁组织中的表达率为7.5%(3/40),差异有统计学意义(P<0.01);PKC-α蛋白的表达在不同病理类型之间(腺癌、鳞癌及细支气管肺泡癌)的差异无统计学意义(P>0.05);与患者的性别、年龄等因素亦无明显相关性;而与NSCLC,特别是腺癌的临床分期、淋巴结是否转移相关(P<0.05);与腺癌的分化程度相关(P<0.05),但与鳞癌的分化程度无明显相关性;在NSCLC细胞株A549、A549-DDP、H460及H1299中均存在PKC-αmRNA及蛋白的表达,其中以A549-DDP细胞株的表达水平为最高。结论:在NSCLC组织及细胞株中存在PKC-α的表达;PKC-α蛋白表达在NSCLC特别是腺癌的浸润、转移和发展中具有重要作用;在多种NSCLC细胞株中PKC-α的表达水平存在一定差别。