用于微弱信号检测的新型锁定放大器设计

针对传统锁定放大器输入信号与参考信号不能时刻保持同步的问题,本文设计了一种新型锁定放大器电路.该电路采用反馈技术,对输入信号与参考信号的相位差进行校准以及对参考信号的频率进行调整,达到输入信号与参考信号同频同相的效果,从而实现微弱信号检测的目的.实验结果表明:基于SMIC 0. 18μm CMOS工艺,在1.8 V的电源电压下,该技术可以实现输入信号与参考信号相对相位自校准以及0.75～1 kHz的频率调谐,也可以从噪声中检测出幅度低至5μV的信号,验证了该电路的可行性,提高了系统的实用性.

白细胞介素-8拮抗剂通过抑制活性氧生成下调视网膜血管内皮细胞黏附和迁移

目的观察白细胞介素-8(IL-8)对视网膜血管内皮细胞(RCEC)黏附和迁移的影响。方法细胞实验研究。将人RCEC(hRCEC)分为正常对照组(N组)、糖基化终末产物(AGE)处理组(AGE组)、AGE诱导联合IL-8抑制剂SB225002处理组(AGE+SB组)。采用蛋白质免疫印迹法观察AGE对hRCEC中IL-8表达水平的影响;细胞划痕实验观察SB225002对hRCEC迁移的影响;流式细胞仪检测SB225002对hRCEC上白细胞黏附、活性氧(ROS)产生的影响。两组间比较行Student-t检验;三组间比较行单因素方差分析。结果与N组比较,AGE组细胞中IL-8表达水平显著升高,差异有统计学意义(t-25.661,P<0.001)。与N组、AGE+SB组比较,AGE组细胞迁移率显著升高(F=29.776),白细胞黏附数量明显增多(F=38.159、38.556),ROS表达水平显著增高(F=22.336),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论IL-8拮抗剂SB225002可能通过抑制ROS的表达而下调hRCEC的黏附和迁移。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子高表达对糖基化终末产物诱导下视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下RPE细胞损伤的保护作用。方法将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组(N组)、空白对照组(N+AGAGEs组)、空载体对照组(Vec+AGEs组)、PSF高表达组(PSF+AGEs组)。N组RPE细胞常规培养;N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导;Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外,其余3组细胞进行相应的转染处理,24 h后应用150μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响;通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响;采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响;采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果HE染色和Hoechst 33258染色观察发现,N组细胞形态饱满,细胞核呈圆形,细胞质丰富,染色均一;N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小,嗜酸性染色增强,细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂;PSF+AGEs组细胞形态尚饱满,细胞浆染色较均匀,细胞核染色均一。MTT比色法检测结果显示,PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力,但该作用可被ZnPP有效拮抗,且差异有统计学意义(F=33.26,P<0.05)。DCFH-DA法检测结果显示,与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较,PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降,差异有统计学意义(F=11.94,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高,差异有统计学意义(F=164.91,P<0.05)。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0μg明显升高,差异有统计学意义(F=104.82,P<0.05)。结论PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生,从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用。

炎症反应在眼底疾病中的作用

包括糖尿病视网膜病变,年龄相关性黄斑变性及眼部新生血管性疾病在内的眼底疾病,机制多样且复杂,但炎症反应在其中的作用不容小觑,通过综述眼底病中炎症作用的研究进展明确炎症反应在其中的重要意义,总结抗炎方法治疗眼底疾病的依据,为治疗眼底疾病提供新的思路。

玻璃体液中细胞因子表达水平与糖尿病视网膜病变发病关系的研究进展

血视网膜屏障破坏、神经损伤、新生血管及纤维增生膜形成作为糖尿病视网膜病变(DR)的重要病理改变与多种玻璃体细胞因子的综合作用相关。VEGF主要参与增加视网膜血管通透性和诱导新生血管形成;色素上皮衍生因子则具有降低血管通透性,神经保护功能;IL在介导炎症反应中起关键作用,在缺氧状态下血浆和玻璃体液TNF-α显著升高,诱导炎症反应;多种眼部结构均可分泌TGF-β,是调节细胞增生分化的重要细胞因子;结缔组织生长因子则可促进内皮细胞生长、迁移和黏附。另有多项具体分子机制尚未完全阐明,需继续深入研究DR发生的分子机制。我们相信随着DR发生分子机制研究的深入,DR的早期干预及靶向治疗的效果将日趋理想。

糖尿病性白内障晶状体上皮细胞焦亡研究

目的探究晶状体上皮细胞焦亡在糖尿病性白内障发生中的可能作用。方法实验研究。选择2020年3至11月就诊于天津医科大学眼科医院行白内障摘除手术的70例(70只眼)患者,收集手术中房水及晶状体前囊膜。根据是否伴有2型糖尿病,分为糖尿病组和非糖尿病组,每组35例(35只眼)。采用Western印迹分析、实时定量PCR和免疫组织化学染色检测晶状体前囊膜Nod样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)、Gasdermin D蛋白(GSDMD)的表达,采用酶联免疫吸附测定法检测房水中白细胞介素(IL)1β和IL-18,并进行两组间比较。主要的统计学方法为独立样本t检验。结果糖尿病组年龄为(70±9)岁,非糖尿病组年龄(71±8)岁,两组年龄及性别分布差异均无统计学意义(均P>0.05)。Western印迹分析显示糖尿病组前囊膜晶状体上皮细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平分别为1.11±0.06、0.95±0.04、0.39±0.03,均高于非糖尿病组的0.81±0.04、0.33±0.11、0.16±0.04,差异均有统计学意义(t=4.38、5.36、4.63,均P<0.05)。实时定量PCR结果显示糖尿病组前囊膜晶状体上皮细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA水平分别为1.98±0.07、54.36±4.88、6.98±1.18,均高于非糖尿病组的1.38±0.16、15.31±1.51、2.41±0.95,差异均有统计学意义(t=3.49、7.64、3.00,均P<0.05)。免疫组织化学染色显示糖尿病组晶状体前囊膜中NLRP3、caspase-1、GSDMD灰度值亦均高于非糖尿病组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。酶联免疫吸附测定法显示糖尿病组房水中IL-1β、IL-18水平分别为(4.178±0.028)、(20.983±0.018)fg/L,均高于非糖尿病组的(4.063±0.017)、(20.509±0.073)fg/L,差异均有统计学意义(t=20.63、37.21,均P<0.01)。结论caspase-1介导的晶状体上皮细胞焦亡以及焦亡导致的炎性介质释放可能参与了糖尿病性白内障的发生和发展。

增生型糖尿病视网膜病变患者外周血差异基因转录组学与基因表达总库的联合分析与验证研究

目的:筛选增生型糖尿病视网膜病变(DR)患者差异表达基因(DEG ),为增生型DR(PDR)治疗提供新的生物学治疗靶点。方法:基础研究。2020年10月于天津医科大学眼科医院检查确诊的PDR患者3例(PDR组)及非糖尿病患者3例(对照组)纳入研究。另外分别选取同期PDR、非糖尿病患者各40例并据此分为PDR验证组、对照验证组。PDR验证组、对照验证组行外周血验证试验;PDR组、对照组进行RNA测序。采用转录组学(RNAseq)测序技术筛选PDR组、对照组DEG。对筛选得到的DEG进行基因注释(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)的信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作网络(PPI)分析。应用基因表达总集数据库查找与PDR相关高通量数据行多队列比对分析,通过Targetscan平台对差异表达的miRNA进行靶基因预测,明确筛选所得DEG与PDR的相关性。采用逆转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法对与PDR相关的DEG mRNA、蛋白表达进行验证。PDR验证组、对照验证组之间PDR相关的DEG mRNA、蛋白相对表达量比较行配对 t检验。 结果:RNAseq测序共筛选出1 337个DEG,上调基因419个,下调基因918个。具有低等电点的直接凋亡抑制蛋白结合蛋白( DIABLO)、锌指和含BTB域10 ( ZBTB10 )、polo样激酶3 ( PLK3 )、调节亚单位1 ( PIK3R1)、B细胞易位基因3 ( BTG3)等基因在PDR组患者中差异表达。GO功能富集分析结果显示, DIABLO、 ZBTB10、 PLK3、 PIK3R1、 BTG3等基因参与了与PDR相关的病理过程。KEGG富集分析结果显示,细胞外基质受体作用、细胞因子调控通路、p53信号通路、半乳糖代谢等糖代谢途径可能参与了DEG涉及过程。PPI分析结果提示,DEG关联蛋白节点越大,关联的节点数量越多,其中 DIABLO、 ZBTB10、 PLK3、 PIK3R1、 BTG3等基因对该作用网络形成作用显著。Targetscan平台预测发现,DR患者房水、玻璃体、血浆中显著差异miRNA与本研究所发现的DEG具有调控关系。与对照验证组比较,PDR验证组患者外周血中 DIABLO、 ZBTB10、 PLK3、 PIK3R1 mRNA、蛋白相对表达量上调, BTG3 mRNA、蛋白相对表达量下调。 结论:PDR患者的DEG为 DIABLO、 ZBTB10、 PLK3、 PIK3R1、 BTG3,其通过调控细胞增生、纤维化及氧化应激等生物学过程参与疾病进程。

骨形成蛋白4对人视网膜微血管内皮细胞糖酵解水平的影响

目的观察骨形成蛋白4(BMP4)对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)中糖酵解水平的影响。方法实验研究。将体外培养的hRMEC分为正常组、4-羟基壬烯醛(HNE)组(4-HNE组)、4-HNE+BMP4处理组(BMP4组)。4-HNE组细胞培养基中加入10μmmol/L 4-HNE;BMP4组细胞培养基中加入10μmmol/L 4-HNE刺激6 h后,再加入100 ng/ml重组人BMP4。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;噻唑蓝比色法检测4-HNE对细胞生存力的影响;细胞划痕实验、Transwell小室法测定4-HNE对细胞迁移能力的影响。采用实时定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测正常组、4-HNE组细胞中BMP4、SMAD同源物9(SMAD9)mRNA、蛋白相对表达量。采用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解代谢水平。组间比较采用单因素方差分析。结果正常组、4-HNE组、BMP4组hRMEC内ROS水平分别为21±1、815±5、810±7。与正常组比较,4-HNE组、BMP4组ROS水平显著升高,差异有统计学意义(F=53.40、50.30,P<0.001)。正常组、4-HNE组细胞生存力分别为1.05±0.05、1.28±0.05;迁移率分别为(0.148±0.005)%、(0.376±0.015)%;穿过小孔的细胞数分别为(109.0±9.6)、(318.0±6.4)个。与正常组比较,4-HNE组细胞生存力、细胞迁移率、穿过小孔细胞数量明显提高,差异均有统计学意义(F=54.35、52.84、84.35,P<0.05)。4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9 mRNA相对表达量分别为1.680±0.039、1.760±0.011;与正常组比较,差异有统计学意义(F=53.66、83.54,P<0.05)。正常组、4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9蛋白相对表达量分别为0.620±0.045、0.860±0.190和0.166±0.049、0.309±0.038;与正常组比较,差异有统计学意义(F=24.87、53.84,P<0.05)。正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平分别为1.21±0.12、2.84±0.24、1.78±0.36,2.59±0.11、5.34±0.32、2.78±0.45和2.64±0.13、5.20±0.28、2.66±0.33;与正常组比较,差异均有统计学意义(4-HNE组:F=86.34、69.75、58.45,P<0.001;BMP4组:F=56.87、59.35、58.35,P<0.05)。4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平比较,差异均无统计学意义(F=48.32、56.33、55.01,P>0.05)。结论BMP4通过糖酵解诱导hRMEC的增生和迁移。

结缔组织生长因子刺激后视网膜Müller细胞基因表达谱的转录组学分析及验证

目的分析和验证结缔组织生长因子(CTGF)刺激对视网膜Müller细胞基因表达谱的影响。方法将体外培养的视网膜Müller细胞分为对照组、CTGF组。对照组细胞采用正常DMEM完全培养基培养;CTGF组细胞采用含有10 ng/ml CTGF的DMEM完全培养基持续培养24 h。收集处于对数生长期的细胞行细胞划痕实验,对比分析两组细胞的细胞迁移率;应用HiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序,获得生物学大数据,在此基础上分析差异表达的miRNA;通过基因注释(GO)功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。基于转录组数据筛选出两组间差异表达倍数位于前10名的基因,分析其基因特征。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot和免疫荧光定性检测对骨形态发生蛋白4(BMP4)的mRNA和蛋白表达进行验证。结果CTGF组细胞迁移率较对照组明显升高,差异有统计学意义(t=3.453,P=0.026)。对照组与CTGF组之间共有325个差异表达基因,其中上调者152个,下调者173个。GO功能显著性富集分析结果显示,差异miRNA的功能主要分为生物学过程、细胞成分和分子功能3类。KEGG通路显著性富集分析结果显示,差异miRNA表达高度富集在神经系统间信号传递、细胞间黏附以及细胞因子与其受体相互作用等相关的通路。分析两组间差异表达倍数位于前10名的基因,这些差异表达基因参与组织炎症反应及纤维化过程等不同的代谢通路及生物学过程。qRT-PCR、Western blot及免疫荧光定性检测结果显示,CTGF组细胞中BMP4 mRNA及蛋白表达均较对照组明显提高,差异有统计学意义(t=39.490、10.110、5.470,P=0.004、0.001、0.006)。结论CTGF通过上调Müller细胞中BMP4的表达而促进细胞的增生和迁移导致组织纤维化并可诱导炎症反应。

骨形成蛋白4促进视网膜血管内皮细胞增生和迁移

目的观察氧化应激条件下骨形成蛋白4(BMP4)对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)的增生和迁移影响。方法将体外培养的hRMEC分为对照组、4-羟基壬烯醛(HNE)处理组(4-HNE组)、4-HNE+BMP4处理组(BMP4组)。4-HNE组细胞培养基加入10μmmol/L 4-HNE;BMP4组细胞培养基加入10μmmol/L 4-HNE刺激6 h后,再加入100 ng/ml重组人BMP4。噻唑蓝比色法检测4-HNE、BMP4对hRMEC生存力的影响。细胞划痕实验测定4-HNE、BMP4对细胞迁移能力的影响。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4 mRNA相对表达量以及对照组、BMP4组细胞中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(Laminin)、α-平滑肌收缩蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ型(CollagenⅠ)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA相对表达量。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4蛋白相对表达量。两组间比较采用t检验。结果与对照组比较,4-HNE组、BMP4组细胞生存力(t=12.73、16.26,P=0.0002、<0.0001)、细胞迁移率(t=28.17、37.48,P<0.0001、<0.0001)均明显提高,差异有统计学意义;4-HNE组细胞中BMP4 mRNA、蛋白相对表达量明显升高,差异有统计学意义(t=16.36、69.35,P=0.0001、<0.0001)。qRT-PCR检测结果显示,与对照组比较,BMP4组细胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、CollagenⅠ、CTGF mRNA相对表达量明显升高,差异有统计学意义(t=10.61、17.00、14.85、7.78、12.02、10.61,P=0.0004、<0.0001、0.0001、0.0015、0.0001、0.0004)。结论BMP4可诱导hRMEC的增生和迁移,并可调控hRMEC中血管生成因子和纤维化相关因子表达。

生物信息学方法在眼底疾病中的应用研究现状

生物信息学是随着生命科学和信息学发展而产生的交叉学科,其主要研究的是基因和蛋白质的表达及其潜在关系。近年来眼科领域的学者们与时俱进,借助基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等平台,将生物信息学的研究方法引入眼底疾病研究中,包括遗传易感基因的筛查、诊断标志物的甄别以及发病机制的探索在内的诸多方面,取得了一系列喜人的研究成果。基因组学具有高效准确的特点,在视网膜母细胞瘤和视网膜色素变性研究中用于检测新的突变位点,有助于进一步完善视网膜遗传性疾病的发病机制。转录组学、蛋白质组学和代谢组学具有高通量的特点,用于分析眼内液或离体细胞在疾病状态下RNA、蛋白质和代谢物表达谱的变化,可用于筛选生物标志物和进一步阐明发病机制。随着技术的进步,生物信息学方法将为眼底疾病的研究提供全新的思路。

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子高表达对糖基化终末产物诱导下人视网膜微血管内皮细胞氧化损伤的作用

目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下人视网微血管内皮细胞(hRMECs)氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉(ZnPP)组及PSF+ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基,置于37°C、95%空气、5%CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP(10 mol/L)处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后,再用ZnPP(10 mol/L)预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激,HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)、磷酸化(p)细胞外调节蛋白激酶(ERK)、核因子2相关因子2(Nrf2)的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126,Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示,PSF组受损细胞核数较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异均有统计学意义(F=27.5、38.7,P<0.05)。流式细胞法结果显示,PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加,较PSF+ZnPP组明显减少,差异有统计学意义(F=126.4,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加,差异均有统计学意义(F=70.1,P<0.05);AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较,差异均有统计学意义(F=474.0,P<0.05);PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加,PSF+/U0126+组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低,差异有统计学意义(F=30.2、489.4,P<0.05)。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路,促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达,从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。

干扰素基因刺激蛋白抑制剂改善视网膜血管内皮细胞白细胞粘附及糖酵解水平

目的观察氧化应激条件下干扰素基因刺激蛋白(STING)抑制剂对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)的影响。方法实验研究。体内动物实验:将雄性健康C57BL/6J小鼠48只随机分为野生型小鼠组(WT组)、糖尿病(DM)组,每组各24只。DM组小鼠经链脲佐菌素诱导建立DM模型。建模成功后,DM组再分为DM+二甲基亚砜(DMSO)组、DM+C176组,每组各12只小鼠。DM+DMSO组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射DMSO;DM+C176组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射STING抑制剂C176共750 nmol。建模后4周,采用免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测WT组、DM组小鼠视网膜STING表达情况;白细胞粘附实验检测WT组、DM+DMSO组、DM+C176组小鼠体内白细胞粘附于hRMEC数量。体外细胞实验:将hRMEC随机分为常规培养细胞组(N组)、DMSO组(加入DMSO干预)、C176组(加入C176干预)。各组加入150μg/ml糖基化终末产物诱导细胞,体外白细胞粘附实验联合4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测白细胞粘附于hRMEC数量;流式细胞仪对粘附的白细胞进行定量分析;H2DCFDA/活性氧(ROS)荧光探针检测细胞中ROS表达情况;Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内糖酵解代谢水平。两组间比较采用t检验;三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与WT组比较,DM组小鼠视网膜中STING表达水平(t=73.248)及mRNA(t=67.385)、蛋白(t=69.371)相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与WT组小鼠视网膜血管中白细胞粘附数量比较,DM+DMSO组显著增加,DM+C176组显著降低,差异有统计学意义(F=84.352,P<0.01)。体外细胞实验:与N组、DMSO组比较,C176组hRMEC上白细胞粘附数量降低,差异有统计学意义(F=35.251,P<0.01);与N组比较,DMSO组、C176组hRMEC上外周血白细胞粘附数量降低,差异有统计学意义(F=26.374,P<0.01);C176组hRMEC内ROS水平较N组、C176组降低,差异有统计学意义(F=41.362,P<0.01);与N组、DMSO组比较,C176组hRMEC的糖酵解水平显著降低,差异有统计学意义(F=68.741,P<0.01)。结论抑制白细胞粘附、ROS生成、下调糖酵解水平可抑制STING表达,从而改善视网膜血管内皮细胞功能。