基于转录组测序的中华鳖SSR和SNP特征分析及性别标记筛选

【目的】挖掘更多中华鳖(Pelodiscus sinensis)性别分子标记,为中华鳖保护、繁育以及遗传多样性的分子机制等研究提供基础。【方法】基于中华鳖转录组测序数据,利用MISA和GATK挖掘中华鳖转录本中SSR和SNP位点信息,开发与中华鳖性别紧密相关的SNP标记。【结果和结论】共组装获得341632条Unigenes,识别到14804个SSR位点,含有SSR位点的Unigenes序列数量为13904条,占总序列的4.1%。中华鳖转录组中SSR位点类型较为丰富,共识别到6种不同核苷酸重复类型,单核苷酸串联重复基元类型的含量最多(10981个),占总位点数的74.18%。SSR位点以重复11~15次为主(6173个),占总位点数的41.70%。转录组SSR的片段长度大部分集中在10~14 bp,占SSR总数的50.01%。搜索到32299个SNP位点,SNP的分布密度为1/1339 bp。SNP变异类型以转换类型为主,转换类型占70.05%,颠换类型占29.95%。SNP测序深度统计发现,在31~100范围内,SNP数目最多,占43.68%。初步筛选并鉴定出位于Ptpn11基因上与性别紧密关联的SNP位点(29144910),为中华鳖性别分子标记提供候选基因和标记。

基于无壳孵化黄喉拟水龟胚胎发育活体观察

文章以黄喉拟水龟(Mauremys mutica)受精卵为材料,通过无壳孵化技术,对黄喉拟水龟胚胎发育进行活体观察,并记录胚胎发育全过程。在孵化温度为(32±0.5)℃时,孵化期平均为54d。在没有卵壳、没有外界水分和氧气的情况下,黄喉拟水龟胚胎能够完成发育全过程并成功孵出稚龟。根据胚胎发育的形态特征、时间将整个发育过程划分为1—19期。1—7期以卵黄囊血管丛、心脏形态与跳动作为分期依据;而8—19期主要以头部、四肢、背甲、颜色和尿囊等作为分期依据。无壳孵化技术在龟类胚胎发育观察中的成功应用,显示其有广泛的潜在应用前景。

中华鳖Dkkl1基因的分子特征及对外源性激素处理的响应

Dkkl1基因在哺乳动物睾丸发育和精子发生过程中扮演着重要角色,然而其在龟鳖类动物中的研究十分有限。为探索龟鳖类Dkkl1基因的潜在功能和作用机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)Dkkl1基因的cDNA片段,分析其序列特征、表达模式以及对外源性激素处理的响应。克隆获得的Dkkl 1基因cDN A序列长度为823 bp,其中3'-非编码区(UTR)为67 bp,5'UTR为90 bp,开放阅读框为666 bp,共编码222个氨基酸。中华鳖Dkkl1蛋白是一种稳定性较差、亲水性较强的碱性蛋白,其二级结构和三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。氨基酸序列同源性比对结果显示其与中华草龟(Chinemys reevesii)Dkkl1蛋白的相似性较高(81%),与棱皮龟(Dermochelys coriacea)Dkkl1蛋白的同源性较低(70%)。通过RT-PCR和RT-qPCR分析发现,中华鳖Dkkl1 mRNA在3冬龄成体精巢中极显著性高表达(P<0.001),而在其余体组织中几乎不表达。并且随着年龄的增长,中华鳖精巢中Dkkl1基因的表达量逐渐上升,并在3冬龄时达到顶峰。此外,17β-雌二醇(E2)和17α-甲基睾酮(17α-MT)处理均可显著抑制成体中华鳖精巢中Dkkl1基因的表达(P<0.05)。研究表明,Dkkl1基因可能在中华鳖睾丸发育和精子发生过程中起着重要作用。

巴沙鱼低眼巨鲶胚胎和仔稚鱼发育观察及其生长模型的确定

为研究巴沙鱼低眼巨鲶(Pangasianodon hypophthalmus)(亲鱼体质量为4.0~8.0 kg)胚胎发育和仔稚鱼发育特点,采用干法授精获得受精卵,观察其胚胎发育和仔稚鱼发育时序特征,并在生化培养箱(SPM-50)进行了不同盐度、温度对其胚胎发育的影响试验。结果表明:低眼巨鲶卵为黏性卵、透明,卵径为(1.60±0.23)mm;在水温为(30±0.5)℃时,其胚胎历经受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵出期7个阶段(共23个发育时期),22 h开始孵出仔鱼,28 h后全部孵出,初孵仔鱼全长为(4.38±0.23)mm;在不同温度和盐度下的孵化试验显示,最佳孵化水温为27~30℃,在此温度下的孵化率最高(49.35%~44.33%),最适盐度为0,在此盐度下的孵化率最高(54.33%),随着盐度的升高,孵化率逐渐降低;在水温为(30±0.5)℃条件下,初孵仔鱼的生长发育历经前期仔鱼(0~2 d)、后期仔鱼(3~16 d)、稚鱼期(17~29 d)和幼鱼期(30 d);初孵仔鱼出膜后第3天卵黄囊完全消失。研究表明,低眼巨鲶孵化期短,最佳孵化温度为27~30℃,最适盐度为0,是典型的热水性淡水鱼类;仔鱼前期生长较慢,20 d后开始增速,属于快速生长的鱼类。

美洲鲥胚胎及仔稚鱼的发育

对美洲鲥(Alosa sapidissima)早期生活史阶段的生长发育特征进行了观察和测量,描述了胚胎和仔、稚鱼的生长发育特征。美洲鲥受精卵球形、无油球,为沉性卵,卵径2.85—3.28 mm。在水温20.3℃—21.9℃孵化条件下,经过82h孵化出膜,根据其胚胎发育过程的形态特征,胚胎发育分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期和出膜期7个发育阶段。美洲鲥初孵仔鱼全长为(8.56±0.36)mm,其卵黄囊体积为(4.57±0.77)mm3。1日龄仔鱼脑部发育明显,口张开,肛门开通,胸鳍形成。2日龄仔鱼卵黄囊体积(0.71±0.23)mm3,只有刚孵化的15.54%。3日龄仔鱼经过1d的混合营养期,卵黄被完全吸收,4日龄仔鱼完全营外源性营养,卵黄囊的体积(V)随孵化时间(h)的变化方程为V=4.1583e-0.0356h(R2=0.9901)。此后,背鳍鳍条、尾鳍鳍条、臀鳍鳍条和腹鳍鳍条相继在晚期仔鱼出现,9日龄仔鱼尾椎开始弯曲,21日龄仔鱼尾椎弯曲完成。27日龄鱼鳞开始形成,到33日龄稚鱼全身披鳞,个体发育进入幼鱼期,仔稚鱼期间的生长模型方程为:TL=0.0049D2+0.5091D+9.2578(R2=0.9885,TL为全长,D为日龄)。

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.

温度对美洲鲥耗氧率的影响

在水温25.3-26．5℃下测定美洲鲥幼鱼的昼夜耗氧率，同时在14、18、22、26、30℃下分别对美洲鲥（体长7．8-9．7em，体重3．51-6．20g）耗氧率进行测定。结果表明：美洲鲥在25．3-26．5℃条件下，昼夜耗氧率范围为0．447-0．838mg／g·h，最低在上午7：00（0．447mg/g·h），最高在下午15：00（0．838mg／g·h）和夜间23：00（0．838mg／g·h），全天平均耗氧率为0．639mg／g·h；在不同温度下，耗氧率随着温度的升高而增加，从14℃时的0．073mg/g·h，增加到30℃时的1．057mg/g·h。

瓯江鼋人工辅助繁育研究

为了解瓯江鼋Pelochelys cantorii的繁殖生物学特性,2021年10月—2022年12月,在浙江省青田县,以2015年救护的一对鼋为研究对象,开展鼋人工辅助繁育研究。结果表明,2022年7—8月,雌鼋成功产卵3窝,每窝产29~44枚卵,共116枚,其中受精102枚,受精率为88.10%;鼋卵圆形,刚性,平均质量为16.54±0.89 g·枚^(-1),卵径3.16±0.18 cm;成功孵出稚鼋86只,孵化率为84.89%,平均孵化期为57.43±4.28 d;刚孵出稚鼋平均体质量为13.67±1.13 g,稚鼋以活鱼苗为饵料,在温室内养殖近100 d,平均体质量达172.21±38.96 g,养殖成活率为100%。本研究在浙江首次将野外获得的野生鼋在人工辅助条件下实现子一代的成功繁育,对丰富瓯江水系的鼋资源水平,维持种群遗传多样性水平,促进浙江省鼋野外种群恢复等方面具有重要的意义。

美洲鲥的形态特征与细胞核型

通过观察、解剖美洲鲥Alosa sapidissima,详细描述了其外部形态和内部结构,并对其核型进行了研究分析。结果表明：美洲鲥体呈纺锤形,鱼体背部为灰黑色,略带蓝绿色光泽;口端位略偏上口位,脂眼睑发达,鳞片较大,侧线不发达,鳃耙细长而致密,第1外鳃弓鳃耙数为24-31＋47-55;鳍式分别为D.3-13-16,P.1-16-17,V.1-8,A.1-2-17-19,C.23;体长分别是体高、头长、尾柄长、肠长和肛前体长的3.48倍、4.19倍、6.88倍、2.12倍和1.44倍,头长分别是吻长、眼径和眼间距的3.60倍、5.13倍和3.99倍,体高是体宽的2.27倍,尾柄长是尾柄高的1.71倍;胃发达呈＂Y＂型,幽门盲囊长且细,有92-115条;鳔2室,与体腔等长;体长（L）与体质量（W）的幂指数关系为W=0.0096L3.1429（n=47,R2=0.9753）,肥满度系数为1.53;染色体数目2n=48,核型公式为4 sm＋44 t,NF=52。

人工驯养鼋繁殖习性研究

鼋(Pelochelys cantorii,1864)属于中国国家一级重点保护野生动物,生物学资料相对匮乏,2015和2016年连续2年对人工驯养的4只亲鼋(2雌2雄)进行了繁殖生物学研究。人工驯养鼋的产卵期集中在5—8月,夜间产卵,无护卵行为。通过视频观察分析,鼋产卵过程可分为Ⅳ个阶段。2只雌鼋2015年共产卵10窝,每窝32—50枚,共406枚,受精273枚,受精率为67.24%,孵出稚鼋140只,孵化率为51.28%;2016年共产卵11窝,每窝40—55枚,共489枚,受精353枚,受精率为72.19%,孵出稚鼋212只,孵化率为60.06%。鼋卵圆形,刚性,均重(16.82±1.99)g,卵直径(3.10±0.18)cm,刚孵出稚鼋均重(13.60±0.85)g,在人工控温下平均孵化期为(64.94±3.47)d。繁殖数据表明这2对鼋处于生育盛年期。针对2016年的繁殖数据分析,2只雌鼋每窝产卵量无明显差异,卵均重和卵直径间有显著相关性,雌鼋1个体体重大于雌鼋2,前者产的卵均重显著大于后者,孵出稚鼋的初重差异也显著,卵大,稚鼋也大。孵出的稚鼋以活鱼苗为饵料,在温室内人工养殖周年,均重可以达(510.30±82.77)g。研究旨在为鼋繁育生物学提供基础性数据,为其资源保护做贡献。

翘嘴鳜、斑鳜及其杂交后代的胚胎和胚后发育比较

利用人工催产、人工授精的方法取得翘嘴鳜Siniperca chuatsi、斑鳜Siniperca schezeri及其正反交杂交后代的受精卵,在常温下对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交后代的胚胎和胚后发育进行了观察与比较。结果表明:4种卵子中,斑鳜及以斑鳜为母本杂交种的卵子大于翘嘴鳜及以翘嘴鳜为母本杂交种的卵子,前者直径为(1.86±0.07)mm,后者为(1.08±0.06)mm。在外部条件相同的情况下,4种胚胎发育时序基本以母本为基准,即以翘嘴鳜为母本的杂交种胚胎发育时序与翘嘴鳜的相同,以斑鳜为母本杂交种的则与斑鳜相同。在水温28.0～30.0℃下,以翘嘴鳜为母本的两种胚胎孵化需时约34 h,而在26.5～30.0℃下,以斑鳜为母本的两种胚胎孵化需时约91 h。以斑鳜为母本的初孵仔鱼比较大,全长为(4.60±0.07)mm,以翘嘴鳜为母本的初孵仔鱼全长为(4.00±0.05)mm。

中华鳖5个群体遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星分子标记技术对洞庭(DT)、黄河(HH)、黄沙(HS)、日本(RB)以及洞庭(DT)与黄河(HH)的杂交子代(DT♀×HH♂)绿卡(LK)5个中华鳖群体的150个个体进行遗传多样性分析。11对微卫星引物扩增出的等位基因数为3～6个,平均等位基因数为4.1818。5个种群相比,绿卡(LK)的平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均观测杂合度和平均多态信息含量最高,分别是2.3969、0.5274、0.5545和0.4660。对种群间的遗传分化分析表明,黄河(HH)和洞庭(DT)之间的遗传分化最小,为0.0233,而洞庭(DT)和日本(RB)之间的遗传分化最大,为0.0969。基于Nei's遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示黄河(HH)和洞庭(DT)及其子代绿卡(LK)亲缘关系较近,而与黄沙(HS)和日本(RB)的亲缘关系较远,最远的为日本(RB)群体。

甲苯咪唑、溴氰菊酯和硫酸铜对美洲鲥的急性毒性研究

采用静水式急性毒性试验法研究了甲苯咪唑、溴氰菊酯和硫酸铜对美洲鲥(Alosa sapidissima)的急性毒性。在15℃、20℃和25℃3个温度下,甲苯咪唑96 h的半致死质量浓度(LC50)为0.226 mg·L-1、0.077 mg·L-1和0.122 mg·L-1,安全质量浓度(SC)分别为0.194 mg·L-1、0.027 mg·L-1和0.063 mg·L-1;溴氰菊酯96 h-LC50分别为0.386μg·L-1、0.234μg·L-1和0.259μg·L-1,SC分别为0.090μg·L-1、0.061μg·L-1和0.082μg·L-1;硫酸铜96 h-LC50分别为0.320 mg·L-1、0.385 mg·L-1和0.186 mg·L-1,SC分别为0.042 mg·L-1、0.115 mg·L-1和0.019 mg·L-1。根据鱼类毒性等级评价标准,可判定甲苯咪唑在20℃时对于美洲鲥为剧毒药物,在15℃和25℃时为高毒药物,溴氰菊酯在3个温度梯度下均属于剧毒类的药物,硫酸铜在3个温度梯度下均属于中毒类的药物。试验结果表明,温度对美洲鲥各种药物的SC影响很大,因此养殖过程中要特别注意根据温度的变化使用药物。

基于微卫星多重PCR技术的黄喉拟水龟亲子鉴定

利用黄喉拟水龟(Mauremys mutica)微卫星标记,筛选出16对微卫星引物,通过优化各引物比例、荧光接头浓度、退火温度和循环次数,建立了基于2组各含8个微卫星位点多重PCR体系的黄喉拟水龟亲子鉴定技术。应用2组微卫星多重PCR体系,通过ABI3130遗传分析仪以及cervus3.0软件对428只黄喉拟水龟进行了个体基因型检测和遗传多样性分析,结果显示,群体的平均等位基因数为14.190,平均多态信息含量为0.748,平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.687、0.771。对89只候选母本及296只子代进行亲子鉴定分析,结果显示:在父本信息未知时,母本鉴定率为87%;母本获得的子代个数范围为1—12,个体间表现出巨大的差异,这为选择育种提供了物质基础。黄喉拟水龟多重PCR亲子鉴定技术的建立为群体遗传多样性分析、家系鉴定管理和选择育种提供了有效的技术手段。

美洲鲥工厂化养殖模式初探

从美国引进美洲鲥受精卵,在广东清远阳山进行了美洲鲥的受精卵的孵化、工厂化苗种培育、养殖等技术的研究。在美洲鲥孵化、苗种培育与养殖中取得了重大突破,使美洲鲥受精卵的孵化率达到80%,苗种培育成活率达到85%,养殖成活率达90%,为我国美洲鲥工厂化养殖发展提供了技术保证。

中华鳖5个不同群体的形态差异分析

通过对中华鳖Trionyx sinensis洞庭(DT)、黄河(HH)、黄沙(HS)、日本(RB)以及绿卡(LK)(洞庭与黄河杂交子代,DT♀×HH♂)5个不同群体16项生物学外部形态性状的测量,采用多元分析方法对其进行比较分析。聚类分析结果表明,绿卡与其母本洞庭群体先聚合,然后再与其父本黄河群体聚为一支,而黄沙和日本群体另外聚为一支,然后两支再汇聚;主成分分析得到了2个主成分,其贡献率分别为51.93%和11.02%,累计贡献率达62.95%;在16个测量参数中挑选9个对判别贡献较大的参数建立5个群体的判别函数,判别准确率为61.7%～89.5%,判别分析结果也显示,中华鳖5个不同群体分为两大支。

乌鳢、斑鳢及杂交种耗氧率与窒息点的初步研究

对乌鳢、斑鳢及其正反交杂交种(斑乌鳢和乌斑鳢)的耗氧率和窒息点进行了初步研究。结果显示:在水温25.1℃条件下,平均体重48.88 g的乌鳢、45.30 g的斑鳢、44.20 g的斑乌鳢和46.76 g的乌斑鳢的耗氧率分别为0.22、0.16、0.19、0.17 mg/g.h,窒息点分别为2.47、1.45、1.18、2.01 mg/L。并分析了这4种鱼耗氧率的昼夜变化规律以及窒息点的差异原因,讨论了4种鱼窒息点高于其他常见鱼的可能性。

中华鳖转铁蛋白基因序列特征及表达研究

转铁蛋白是呼吸链的关键因子,参与体液和免疫系统的调节,具有抗菌抗病毒等功能。研究从嗜水气单胞菌诱导的中华鳖肝脏SMART c DNA文库中,分离克隆了中华鳖转铁蛋白基因c DNA和g DNA全序列,对其序列特征、组织表达及原核表达进行了分析研究。结果显示,中华鳖转铁蛋白对应全长c DNA的基因组DNA全长为19100 bp,由17个外显子和16个内含子组成;c DNA全长为2359 bp,开放阅读框为2094 bp,编码697个氨基酸;转铁蛋白的分子量为76.6 k D,包含2个糖基化位点,存在4个二硫键形成区域的缺失,两个同源结构域的相似性为37%,信号肽位于第1—19位点。荧光定量PCR结果显示,正常组中华鳖转铁蛋白基因在肝脏中的表达量最大;以嗜水气单胞菌刺激后,其在心、肝、脾和肾脏组织中的表达,均有一个上调后减少的趋势。此外,实验还进行了重组转铁蛋白原核表达和Western blot检测鉴定,为深入研究中华鳖转铁蛋白功能的提供了基础数据。

麦溪鲤肌肉营养成分分析

利用常规肌肉营养检测方法测定了麦溪鲤肌肉营养成分。结果表明,麦溪鲤肌肉中水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分的质量分数分别为76.50%、14.81%、6.85%、1.11%。麦溪鲤肌肉中检测出17种氨基酸,氨基酸总量占鲜样重的13.05%,其中鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)总量为5.09%,必需氨基酸占总氨基酸(EAA/TAA)比例为38.31%。根据氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS),麦溪鲤肌肉限制性氨基酸为甲硫氨酸+半胱氨酸。麦溪鲤肌肉共检测出脂肪酸25种,饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸(SFA/UFA)含量比为0.64:1,富含的十六碳酸(C16∶0)和油酸甲酯(C18∶1n9c)占到全部脂肪酸含量的70%以上。

美洲鲥工厂化养殖模式初探

美洲鲥分布于北美洲东西沿岸的河流和海洋中，与濒临灭绝的中国鲥一样，是一种具有较高营养价值和经济价值的溯河产卵洄游性鱼类。2008、2009年连续2年，我们从美国引进了美洲鲥受精卵，对美洲鲥进行了甘种培育、工厂化养殖等相关技术的研究，并取得了重大突破，使美洲鲥的受精卵孵化率达到80％，