高压超短电场脉冲高选择性兔下腔静脉血管平滑肌细胞消融模型建立的探索

目的高压超短电场脉冲通过瞬时、高能的局部电场变化,具有不破坏细胞完整结构、诱导细胞自主凋亡的生物学效应,这在抑制血管重构、管壁增生、血管狭窄方面具有潜在的应用价值。本研究自主研发出一款新型高压超短电场脉冲系统,探究该系统对兔下腔静脉作用后的生物学效应。方法利用1000 V/cm、1 Hz高压超短电场脉冲电刺激实验兔下腔静脉60次,常规饲养后,在术后第3天处死后,解剖分离实验兔下腔静脉血管标本,送HE病理染色常规检查。结果成功制备自主研发新型高压超短电场脉冲系统,高压超短电场脉冲作用点区域平滑肌凋亡,血管壁变薄,局部血管内皮细胞无明显损伤;无电刺激对照区域血管内皮细胞、平滑肌细胞及血管壁结构完整。结论高压超短电场脉冲,具有高选择性消融平滑肌细胞,保持周围血管内皮及平滑肌细胞、组织结构完整性的作用。

纳秒脉冲电场局部消融小鼠三阴性乳腺癌的研究

目的三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)是难治性的恶性肿瘤。纳秒脉冲电场(Nanosecond Pulsed Electric Field,nsPEF)是一种新型的局部消融方法,适用于浅表肿瘤的治疗。本研究旨在探究nsPEF消融小鼠TNBC的合适场强,并验证其治疗效果。方法分别利用0、20、30 kV/cm的场强进行小鼠4T1肿瘤消融细胞凋亡的研究,并探究免疫细胞浸润的情况。结果30 kV/cm场强组肿瘤完全消融率达54.5%,脉冲后0 h和24 h肿瘤细胞总体凋亡率分别为74.0%、34.8%。CD8^(+)和CD4^(+)T细胞主要位于对照组肿瘤边缘,脉冲后肿瘤内部浸润增加,特别是在消融边界区。结论30 kV/cm的场强可有效消融小鼠TNBC,nsPEF促进免疫细胞向肿瘤内部浸润。

纳秒脉冲消融乳腺癌及免疫激活效应的实验研究

近20年的动物实验及临床前期研究表明,纳秒脉冲具有能量高、微创治疗、不需联合化疗药物等优点。因此本研究将纳秒脉冲作用于MDA–MB–231乳腺癌荷瘤小鼠,观察局部原发肿瘤的消融效果,随访局部消融对免疫细胞亚群的影响情况,探索其非热消融的免疫机制。本实验在小鼠皮下接种小鼠乳腺癌MDA–MB–231细胞,2周肿瘤直径达到10 mm时进行纳秒脉冲局部消融治疗,治疗参数选择脉冲宽度为300 ns,电场强度为40 k V/cm,脉冲个数为100,治疗频率为隔日重复共3次。研究结果表明原位接种的MDA–MB–231乳腺癌细胞成瘤率达到100%。纳秒脉冲治疗后随访肿瘤大小、形态及体积至1个月,肿瘤直径达到20 mm时结束动物实验,B超监测数据显示,纳秒脉冲局部消融对原位肿瘤的消融率为83%,显著降低了原发肿瘤的体积,与对照组相比具有显著性降低;用流式细胞术检测脾脏中各淋巴细胞亚群的变化。射频消融后,小鼠脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和比例升高,提示局部使用的纳秒脉冲刺激脾脏T细胞增殖能力。纳秒脉冲消融不但能够抑制原发肿瘤,还能增强小鼠免疫功能,使得肿瘤生长和转移侵袭力下降,有助于抑制肿瘤的生成及发展。

HTK液冷保存大鼠后肾原基同种和异种移植研究

目的比较Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate (HTK)与Uinversity of Wisconsin Solution (UW)液冷保存大鼠后肾原基同系和异种裸小鼠移植的效果,探索器官保存液评价新模型.方法从受孕第16天(E16)近交系Lewis(RTl1)大鼠提取后肾原基,以0~4℃HTK或UW液保存24、48、72、96 h,植入Lewis鼠(Lewis→ Lewis)和BALB/c裸小鼠(Lewis→BALB/c)网膜.体外比较原基乳酸脱氢酶(LDH)释放率(%)和三磷酸腺苷(ATP)存量(%);在体观察发育后肾结构,比较后肾移植成活率和移植后肾菊粉清除率.实验所得数据以均值±标准差(Mean±SD)表示,率的比较采用x2检验,两独立样本比较采用t检验,其他参数作方差分析.结果 HTK冷保存24、48、72、96 h,原基LDH释放率分别为(6.5±1.1)%、(8.6±0.9)%、(11.3±1.3)%、(12.5±0.8)%,逐渐升高,各时段均较UW液组为低,差异无统计学意义(F=0.752,P> 0.05);ATP存量为(71.8±4.6)%、(53.7±4.8)%、(35.8±3.4)%、(11.1±1.7)%,逐渐降低,尤以96 h明显,在72 h较UW液组低(t=-2.725,P<0.05),其余时段相当(F =0.812,P>0.05).经HTK液保存3d,E16后肾原基体积和结构无明显变化,在同种(Lewis→Lewis)或异种(Lewis→BALB/c)网膜中都发育良好,病理和电镜检查正常;HTK液保存24、48、72、96 h的受体Lewis鼠和裸小鼠后肾移植成活率分别为100.0%、100.0%、73.3%、0%(2=1.553,P >0.05)和100.0%、100.0%、80.0%、0%(x2=0.653,P>0.05);保存72 h Lewis鼠移植后肾菊粉清除率(32.10 ±5.09)μl/(min·g),与UW液差异无统计学意义(t=-0.264,P>0.05).结论大鼠E16后肾原基以HTK液保存3d,可以在同种和异种受体网膜内生长发育,形成器官并发挥功能.后肾原基同系或异种裸小鼠移植可能是评价器官保存液的有效模型.

大鼠胸腺联合后肾原基环磷酰胺预处理移植研究

目的将大鼠胚胎胸腺联合后肾原基同种和异种移植至环磷酰胺(CP)预处理去胸腺受体鼠,探讨能否诱导供体特异性免疫耐受.方法从受孕第16天(E16)的Lewis大鼠胚胎中提取成对胸腺和后肾原基,分别植入以CP预处理(BN鼠80 mg/kg、C57BL/6鼠200 mg/kg,腹腔注射,q6d×4)的去胸腺实验(Ⅰ)组或对照(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组受体腹腔,术后CP用量减半并联合环孢素[CsA,BN鼠8 mg/(kg·d)、C57BL/6鼠CsA12 mg/(kg·d)]皮下注射,每日一次×12 d,给药至第13天停药.移植后行胸腺、后肾移植物的形态学及功能检查,检测受体鼠血清白细胞介素(IL)-2和干扰素-γ(IFN-γ)含量、单向混合淋巴细胞反应(MLR)及皮肤移植试验.率的比较采用x2检验,两独立样本比较采用t检验,其他参数作方差分析.结果异种移植后14 d,C57BL/6鼠未见Lewis鼠胸腺和后肾原基生长.同种移植后21 d,部分实验(Ⅰ)组BN鼠胸腺及后肾发育尚好,显示一定的泌尿功能.实验(Ⅰ)组BN鼠Banff排斥反应分级最轻(x2=6.316,P<0.05),血清IL-2和IFN-γ含量分别为(388.92±55.98)ng/L(F=9.794,P<0.01)和(51.37±7.43)ng/L(F=4.120,P<0.05),与对照(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组差异有统计学意义.对供体Lewis和无关Wistar鼠移植皮片平均存活时间分别为(8.7±0.8)d和(5.8±1.2)d,两者差异有统计学意义(t=4.867,P<0.01);与对照(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组差异有统计学意义(F=17.421,P<0.01);对MLR脾细胞刺激指数(SI)分别为1.7±0.2和3.7±0.4,两者差异有统计学意义(t=-11.688,P<0.01);与对照(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组差异有统计学意义(F=12.787,P<0.01);各(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)组对第三品系Wistar鼠皮片存活时间(F=0.756,P>0.05)和SI差异无统计学意义(F=0.920,P>0.05).移植后5~7周,移植后肾和胸腺排斥反应加重,逐渐形成结缔组织瘢痕.结论使用CP预处理方案,Lewis鼠E16胸腺和后肾原基,在异种C57BL/6鼠腹腔内未能生长发育;在同种BN鼠腹腔内可继续发育,形成器官,尽管未诱导出免疫耐受,但可产生供体特异性免疫低反应.

细胞排斥反应与不同胎龄大鼠后肾移植发育的关系研究

目的探讨细胞排斥反应与不同胎龄大鼠后肾同种和异种移植发育的关系。方法不同胎龄(E14~E19)大鼠后肾分组植入远交系(Sprague Dawley,SD→SD鼠分6组,每组n≥10;E15~E17SDCsA三组,每组n=15)、同系(Lewis→Lewis鼠分5组每组n=8)、同种异体(Lewis→BN鼠,E15BN组n=6,E15BNCsA组n=10,E16BNCsA组n=10)或异种(Lewis→C57BL/6鼠,E15C57组n=10,E15C57CsA组n=8;Lewis→Balb/c裸小鼠分三组,各组n=10)受鼠网膜,观察移植后肾组织病理、Banff排斥分级和电镜结构,测量移植后肾生化和泌尿功能。结果移植后4周,SD→SD移植Banff分级E14SD、E15SD较轻,E16SD、E17SD次之;E18SD、E19SD最重。环孢素A(Cyclosporine A,CsA)8 mg·kg^-1·d^-1抗排斥,E15~E17SDCsA三组Banff分级明显减轻(P<0.01)。Lewis→BN移植,E15BN后肾完全排斥;CsA12 mg·kg^-1·d^-1给药,E15BNCsA和E16BNCsA组Banff分级皆减轻(P<0.05),停用CsA后两组后肾被排斥。Lewis→Lewis同系移植,E15~E17Lewis三组后肾皆发育良好;E14Lewis和E18Lewis较差。Lewis→C57BL/6异种移植后14 d,E15后肾严重排斥,使用CsA 15 mg·kg^-1·d^-1无改善。Lewis→Balb/c裸小鼠移植,E15~E17Balb/c三组皆发育良好,结构正常,湿重和移植后肾肌酐、尿素氮差异无统计学意义(P>0.05)。E15Lewis和E16Lewis后肾湿重最轻,内生肌酐清除率最高,E15SDCsA、E16SDCsA居中,E15SDCsA后肾湿重最重,内生肌酐清除率最低(P<0.01)。结论大鼠E15、E16和E17后肾原基在控制排斥反应后,同种和异种移植的发育性能相似;细胞排斥反应是阻碍不同胎龄后肾同种和异种移植发育的主要因素。