Vero细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了研究新孢子虫与Vero细胞的相互作用蛋白,试验以体外培养的Vero细胞为材料,构建了Vero细胞酵母双杂交c DNA文库。首先,提取Vero细胞的总RNA,经反转录合成第一链c DNA,以SMART方法合成双链c DNA,通过柱层析去除200 bp以下片段;然后,将纯化的双链c DNA与p GADT7-Rec一起转到酵母Y187感受态细胞中,并发生同源重组;最后,计算文库效价、文库容量及文库的重组率。结果表明：文库效价为7.1×108cfu/m L,文库容量为1.8×1010cfu,重组率为100%,插入片段长度在500~2 000 bp之间,达到了建库要求,可用于Vero细胞和新孢子虫蛋白质相互作用的筛选。

瑟氏泰勒虫p33基因与牛IL-18基因的串联表达

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。

猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。

吉林省延边地区自然生境内蜱种类的调查

目的 调查吉林省延边地区自然生境内蜱的种类和分布。 方法2014年5—7月在延边地区龙井市、珲春市、延吉市3个市的6个调查位点用布旗法采集游离蜱类样本，显微镜下依据经典蜱类形态学种属鉴定蜱的种类。 结果 共采集的蜱280只，隶属2属2种，其中长角血蜱占94．64％（265／280）、全沟硬蜱占5．36％（15／280）。龙井市采集的86只蜱中，长角血蜱和全沟硬蜱的比例分别为83．72％（72／86）和16．28％（14／86） 珲春市采集的187只蜱中，长角血蜱和全沟硬蜱的比例分别为99．47％（1．86／187）和0．53％（1／187） 延吉市采集的7只蜱全部是长角血蜱。 结论延边地区自然生境内主要以长角血蜱和全沟硬蜱为主，长角血蜱是优势蜱。

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA（ds cDNA）。利用CHROMA SPINT＋TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。