海岛棉NBS类型抗病基因类似物的起源、多样性及进化

利用已克隆植物的R基因NBS序列中保守模体合成简并引物 ,以海岛棉品系Pima 90 (Gossypiumbarba dense)基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,通过T A克隆、测序和序列比较分析共得到 31条RGAs ,其中 1 9条具有连续的ORF。利用海岛棉的 31条RGAs与GenBank中陆地棉种质系M 2 4 9(Gossypiumhirsutum)的RGAs进行了比较分析 ,RGAs可分为两大类 :其中第Ⅰ类全部为陆地棉的RGAs;第Ⅱ类分别包括了陆地棉和海岛棉的RGAs。同时对海岛棉RGAs的核苷酸和氨基酸序列进行系统发育树分析 ,表明海岛棉RGAs可分为TIR(DrosophilaTollorhumaninter leukinreceptor like)和non TIR两类 ,与前人所报道的R基因进化一致。对 1 9条具有连续ORF的RGAs进行了结构分析 ,结果表明它们包括P loop、Kin 2、“PLAL”及Meyers等所定义的RNBS A、B、C 3个模体。结果表明 。

黄萎病菌诱导的海岛棉抗病反应的SSH文库构建及分析

在Pima90幼苗接种黄萎病病原菌后2、4、8、12、24、48、72和96h分批取幼根以抽提棉花总RNA。以未接种病原的棉花cDNA为驱动方,利用SSH法对接种病原后的棉花cDNA进行差减杂交。对杂交后的cDNA进行T/ A克隆并转化到大肠杆菌中完成文库构建,共获得了534个克隆。以M13引物对扩增插入片段进行PCR扩增,电泳结果显示插入片段大小从0.2～1.2kb不等,平均大小为0.5kb。将克隆中的插入片段点种于尼龙膜上,分别以病原诱导前后的总cDNA为探针进行反向Northern杂交。对78个在海岛棉的抗病反应中呈上升表达的克隆进行了测序并对测序结果去载体后在NCBI上利用Blastn和Blastx进行序列相似性分析。结果表明,大部分阳性克隆与拟南芥等多个物种不同逆境条件下诱导的相关基因或表达序列相同或同源,如棉花病程相关蛋白家族10,拟南芥抗病反应家族蛋白等。SSH文库的构建和分析将有助于了解棉花抗黄萎病反应的分子机制。

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。

棉花纤维发育和体细胞胚发生过程中实时定量PCR内对照基因的筛选

实时定量PCR技术(qRT-PCR)能够快速地对多个样品进行基因表达分析,因此已成为芯片和微点阵数据验证的常用手段.为了得到更精确的数据,通常需要一个和多个内对照基因来平衡化qRT-PCR数据.目前一般选择持家基因(housekeeping gene)作为内对照,但很多持家基因的表达水平随着环境的改变而改变.在棉花纤维发育和体细胞胚发生机制研究过程中已经产生大量芯片和微点阵数据,但目前在采用实时定量PCR验证这些数据时都只用了一个持家基因来平衡化数据.为了验证其可靠性,本研究根据常用的持家基因(18S rRNA,Histone3,UBQ7,Actin,Cyclophilin,Gbpolyubiquitin-1和Gbpolyubi-quitin-2)设计了7对引物,用相对的绝对定量法验证了在棉花不同组织和不同发育阶段(21个样品)表达水平的稳定性,发现在纤维发育的后期(17 DPA(day post anthesis)以后),这些基因的表达都下调,而纤维发育后期特异表达基因AGP的表达从15DPA开始到27DPA一直都呈上升趋势.因此对于纤维系列特别是纤维发育后期基因的qRT-PCR更好的选择是相对的绝对定量.而对于非纤维系列,这些持家基因的表达水平相对纤维系列变化幅度较小,但为了得到更精确的表达数据,应该同时用Histone3,UBQ7和Gbpolyubiquitin-1一起来平衡化qRT-PCR数据.

类黄酮代谢途径与棉花纤维发育

棉花纤维是最重要的天然纤维,育成五彩缤纷且品质优良的彩色棉花一直是棉花遗传育种研究的一个重要目标.类黄酮是植物重要的次生代谢物质,与色素形成相关.本文综述了类黄酮代谢途径与棉花纤维发育的研究进展:棕色棉纤维色素物质可能主要是氧化的原花青素;棉花人工驯化过程中,类黄酮代谢途径在白色棉花中下调,但白色棉花表达谱数据显示,类黄酮代谢相关基因在纤维发育过程中仍然非常活跃;一般认为,类黄酮含量与纤维品质负相关,柚皮素和二氢山柰酚可能是抑制纤维发育的主要类黄酮;类黄酮代谢和木质素代谢有共同的代谢前体,木质素代谢相关基因在纤维发育过程中也很活跃,有效调控类黄酮代谢的同时,协调木质素代谢的水平可能会促进纤维发育.

海岛棉EST-SSR引物的开发与应用研究

现有的棉花EST-SSR引物大都开发于中棉和陆地棉,尚没有海岛棉EST-SSR开发研究的报道.本研究从实验室构建的海岛棉纤维发育的cDNA文库中先取98条EST序列设计了119对EST-SSR引物.在这些SSR中,三核苷酸重复基序AAG含量最为丰富,达11.76%.用36份材料(13份A基因组二倍体材料,11份D基因组二倍体材料和12份AD基因组异源四倍体材料)评价新EST-SSR引物,119对引物中有76对成功扩增,共产生313条多态性条带,平均每对引物产生4.11条.这些引物的多态性信息含量(PIC)变化在0.17～0.95之间,平均0.53.根据Jaccard’s遗传相似系数对所用36份材料进行了聚类分析,聚类结果为3大类,分别为A基因组材料、D基因组材料和AD基因组材料.此外,有21对引物在本实验室的种间回交群体((鄂棉22×Pima3-79)×鄂棉22)DNA中表现多态性扩增,产生24个多态性位点,其中22个被锚定于该遗传连锁图的12条染色体.本研究不仅详细地概括了这批新的EST-SSR引物的特征,而且有力地证明了其在遗传多样性分析及遗传连锁图构建方面的应用价值.

棉花细胞初始脱分化的基因差异表达分析

植物激素诱导初期是体细胞胚胎发生的关键时期,它包含了一个通过细胞脱分化获得细胞全能性的过程.为了揭示棉花细胞脱分化的分子机制,利用抑制差减杂交方法建立了一个cDNA文库.共有286个差异表达的cDNA克隆测序并鉴定,112个独立的EST在激素诱导初期明显地上调表达,其中有40.2%的EST是第一次被分离鉴定.GST在植物激素诱导初期的6～24h高度表达,PRPs在不同的处理中优势表达并表现出不同的表达模式,表明它们与棉花细胞脱分化关系密切.棉花SAM代谢途径中假定的GhSAMS,GhSAMDC,GhSAHH和GhACO3被鉴定,qRT-PCR分析表明,它们的表达水平在激素诱导初期出现两次明显的上升/下降过程,且GhSAMS和GhSAHH表现出高度正相关,高表达水平的GhSAMS可能与脱分化细胞重新进入细胞周期密切相关.组织形态学观察进一步表明,2,4-D处理条件下的部分细胞在72h内完成脱分化和分裂过程,SAM-dependent转甲基途径可能通过两次转甲基活性的改变调控棉花细胞脱分化过程.此外,差异表达基因在不同处理中的表达模式表明了2,4-D和激动素之间存在着复杂互作关系.